舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，约占头颈部肿瘤的40-50﹪，手术、放疗、化疗是目前主要的治疗手段，但总的治疗效果并不理想，5年生存率仍只有60﹪左右，而且患者生存质量也不高。 癌的发生是一个多因素、多阶段、复杂渐进的过程，干预或终止其中某个或多个相关因素或过程，能够改变癌发生发展的进程，达到化学预防和治疗的目的。针对肿瘤相关因子，明确基因功能，选择靶点进行化学干预，是恶性肿瘤的预防和治疗策略。癌化学预防(cancer chemoprevention)就是利用天然化学物质和合成化学物质，开展抑制或延迟从正常细胞发展到进行期癌的癌变过程。实施癌的化学预防首要的是确定和选择作用靶点，即研究肿瘤相关基因的功能和表达。 一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体内一种小分子气体。它为一种结构简单的自由基，具有氧化还原性。NO具有十分重要的生理功能，其通过第二信使以及神经递质的性能，参与调节生物体的循环、神经、免疫等一系列生理过程，同时也参与包括肿瘤在内的许多病理过程。NO为一种自由基，通过多种机制发挥抗肿瘤作用；然而近期的大量临床和实验研究表明，NO与一些肿瘤相关因子相互作用，具有促进肿瘤生长、发展、侵袭、转移的作用。NO对肿瘤的“双刃剑”作用与肿瘤组织局部NO浓度、肿瘤类型、以及肿瘤细胞对NO的敏感性等多种因素有关。 内源性NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)以L-精氨酸为底物氧化合成的，NOS的表达是衡量内源性NO的重要指标。生物体内的NOS至少有三种类型，其中诱导型(iNOS)由活化的巨噬细胞诱导产生，作用缓慢而持久，其产生的NO量较多。许多肿瘤细胞中均可见iNOS表达，但不同类型的肿瘤组织中iNOS的表达和NO的释放有所不同。头颈部肿瘤中iNOS的表达比正常粘膜中的表达要高；有淋巴结转移的iNOS的活性比无淋巴结转移要高得多。前列腺素E2及其合成酶环氧合酶-2(COX-2)在肿瘤发生发展有很多分子机制发挥作用，如如前列腺素的生物合成、促进肿瘤血管生成、细胞调亡抑制、免疫抑制、异生化合物代谢等。COX-2与iNOS之间存在一种“串话”(cross talk)机制，COX-2和iNOS在组织分布，表达调控等方面表现相似，共同参与一些生理、病理过程、相互作用能促进肿瘤的发生发展，表现为协同作用。COX-2和iNOS间的分子相互作用机制还没有完全明了，不同的研究甚至出现相反的结论。这两种酶在舌鳞癌表达增高的原因及其在舌鳞癌发生发展中作用具体机制和两者抑制剂在舌鳞癌的防治作用是进一步研究的目标。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。RNAi是真核生物中普遍存在，是生物体在进化上的一种保守的基因组水平的免疫监控机制。作为一种新的反向遗传学研究基因功能的方法克服了正向遗传学中预测性基因功能分析的存在假阳结论的缺点，这种高通量的基因沉默技术能够抑制生物体基因组内每一条基因的表达，从整体系统地研究基因的功能及不同基因间的关系。 为了进一步探讨iNOS和COX-2基因对肿瘤细胞增殖活性的影响以及两个因子表达间的关系，为后期进行体内和临床实验研究提供理论依据，本实验采用了RNA干扰技术，通过阳离子脂质体LIPOFECTAMINE 2000介导，将含有针对iNOS的特异性stealth RNA转染入舌鳞癌细胞Tca113中。流式细胞仪和MTT法分别检测Tca8113细胞的凋亡和增殖活性的变化情况；RT-PCR实验检测手段，分别从mRNA水平检测iNOS和COX-2基因的表达改变情况。 本研究分两个部分进行： 第一部分：RNA干扰iNOS基因对舌鳞癌细胞增殖活性影响的实验研究为研究NO和iNOS对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，本实验用脂质体LIPOFECTAMIN2000介导，将invitrogen公司设计并合成的iNOS特异性的Stealth RNA转染入舌鳞癌Tea8113细胞株，同时设立阴性对照和空白对照。免疫组化检测细胞中iNOS的蛋白表达改变情况；流式细胞仪检测Tca8113细胞的凋亡率；MTT法绘出各组细胞的生长曲线，以进一步检测细胞增殖活性的变化情况。 免疫组化结果发现：实验组Tca8113细胞中iNOS表达水平低于两对照组；实验组(iNOS组)的肿瘤细胞凋亡率高于两对照组，而两对照组之间的凋亡率无统计学意义。说明RNAi降低iNOS基因的表达，使肿瘤细胞的凋亡有所增加；根据吸光度OD值绘制出生长曲线(见附图1-8)。从图可见实验组Tca8113细胞的增殖活性受到明显抑制。 第二部分：iNOS基因沉默抑制Tca8113细胞COX-2表达的实验研究前期实验已证明RNAi能让iNOS基因表达下降，为了能进一步探讨iNOS基因是否存在对肿瘤细胞COX-2的表达有调控作用，为后期进行体内和临床实验研究提供理论依据，本实验采用LIPOFECTAMINE 2000脂质体介导，将含有iNOS特异性的Stealth RNA转染入舌鳞癌Tca8113细胞中，通过RT-PCR实验检测手段，从mRNA水平检测Tca8113细胞中iNOS和COX-2表达的改变情况。 结果显示iNOS特异性Stealth RNA转染Tca8113细胞后，iNOS基因和COX-12基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均有降低。 结论 综合上述实验结果，可以得出结论： 1．舌鳞癌Tca8113细胞中有iNOS和COX-2的高表达； 2.RNAi可以降低iNOS基因的表达，达到基因沉默的效果； 3．通过RNAi沉默iNOS基因可提高Tca8113细胞的凋亡，并降低Tca8113细胞的细胞增殖活性； 4.iNOS和COX-2之间存在着密切联系，iNOS沉默后可以降低Tca8113细胞COX-2的表达水平；