【摘 要】
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目的将人胚胎干细胞（hESCs）诱导分化为角膜上皮祖细胞,构建组织工程角膜上皮片（AM+ES-CE上皮片）,用于治疗角膜上皮干细胞缺乏症。方法将hESCs接种于低吸附培养板中,使用NP培养基分化培养8天后获得中间体细胞球,然后将细胞球消化成单个细胞,接种于培养皿中,使用上皮分化培养基继续分化7天,随后接种于去上皮羊膜表面,继续使用上皮分化培养基培养,构建出组织工程上皮片。每个阶段进行细胞分化状态检
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目的将人胚胎干细胞（hESCs）诱导分化为角膜上皮祖细胞,构建组织工程角膜上皮片（AM+ES-CE上皮片）,用于治疗角膜上皮干细胞缺乏症。方法将hESCs接种于低吸附培养板中,使用NP培养基分化培养8天后获得中间体细胞球,然后将细胞球消化成单个细胞,接种于培养皿中,使用上皮分化培养基继续分化7天,随后接种于去上皮羊膜表面,继续使用上皮分化培养基培养,构建出组织工程上皮片。每个阶段进行细胞分化状态检测及细胞标志物检测。将构建的上皮片移植至兔角膜上皮干细胞缺乏模型中,观察眼表面情况及细胞分化状态。结果人胚胎干细胞在NP培养基中悬浮培养8天后可分化成神经球样中间体,将神经球样中间体消化成单个细胞于培养皿中分化7天后接种于去上皮羊膜或培养皿中继续分化培养7天,PCR及免疫荧光染色显示P63、Pax6、Pan-CK和K14呈阳性表达。H＆E染色显示接种于羊膜表面可以成功构建复层上皮样组织,单细胞测序结果证明诱导分化过程中每个阶段的细胞都具有其独特的生物学特性。通过对胚胎干细胞标志物POU5F1,角膜缘干细胞标志物ABCG2、LGR5、P63、K14和K15,上皮细胞标志物K7与K19,角膜上皮细胞标志物K3与K12,结膜上皮细胞标志物K13,以及皮肤上皮标志物K1的检测发现,诱导分化的细胞属于角膜缘上皮祖细胞。之后将构建的上皮片移植至兔角膜上皮干细胞缺乏模型中,未接种细胞的羊膜作为对照（AM对照组）,8周后,实验组角膜透明度与正常组类似,而对照组的角膜被新生血管膜覆盖,透明度差。H＆E染色及免疫荧光染色显示,实验组的角膜缘形态及中央角膜上皮形态与正常角膜类似,且表达角膜上皮细胞标志物K3/K12。而对照组角膜缘与中央角膜都只有1-2层上皮细胞。人核特异性抗体染色显示移植8周后兔角膜表面仍有大量hESCs来源的细胞存在。结论人胚胎干细胞在特点的培养分化条件下,在较短的时间内可获得Pax6阳性表达的角膜上皮祖细胞。构建的组织工程角膜上皮片（AM+ES-CE上皮片）,为治疗角膜上皮干细胞缺乏提供了新的细胞来源。
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