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CRISPR/Cas基因编辑技术日渐成为基因编辑的主流工具,在酿酒酵母和链霉菌中都有着较为广泛的应用。其中,CRISPR/Cas9技术因其简便高效的特点已被广泛用于酵母及链霉菌的基因插入、置换和敲除。本课题将CRISPR/Cas9技术分别应用于一株高产青蒿酸的酿酒酵母工程菌株S.cerevisiae 1211和一株高产制霉素的链霉菌工程菌株Streptomyces sp.ZY01,以期提高两株菌的工业应用价值。酿酒酵母工程菌株S.cerevisia121 1是由海正药业提供的产青蒿酸原始菌株,但在发酵过程中需要向培养基中添加1%的半乳糖,以诱导青蒿酸的产生。为降低企业发酵成本(半乳糖约占1 5%左右),本研究拟敲除该菌株参与半乳糖诱导相关基因gal80;因菌株S.cerevisiae 1211包含了几乎所有已知在酵母中可用的抗性基因,传统敲除方法很难找到合适的筛选标记,所以第一部分内容使用CRISPR/Cas9技术进行基因阻断。由于我们选用的CRISPR/Cas9敲除质粒pML104携带乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因ura3作为筛选标记,因此本研究首先通过5-FOA诱变获得乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因ura3突变菌株S.cerevisiae 1211-1;同时构建了敲除质粒pML104-gal80,利用重组质粒中靶向gal80基因的引导RNA(sgRNA)介导的CRISPR/Cas9系统敲除半乳糖代谢负调控基因gal80获得菌株S.cerevisiae 121 1-2。并且通过正交实验对该菌株的摇瓶发酵工艺进行优化,在最佳发酵条件下(发酵培养基Ⅲ、1%的接种量、发酵84 h)摇瓶发酵产量达到了 740 mg/L。但菌株S.cerevisiae1211-2在后续50L中试发酵实验中,很难利用对青蒿酸积累起到决定性作用的碳源-乙醇,同时菌体生长较慢,我们推测菌株的尿嘧啶营养缺陷影响了其生长及青蒿酸产量。据此我们使用CRISPR/Cas9质粒pML104-KanMx4(不含ura3筛选标记)构建了重组质粒pML104-KanMx4-u,用于介导ura3基因功能区的插入,最终获得改造菌株S.cerevisiae 121 1-3。在摇瓶发酵和50 L中试发酵两个层面对改造菌株S.cerevisiae 121 1-3及原始菌株S.cerevisiae 121 1进行发酵验证,发酵液的HPLC检测结果表明:改造菌株S.cerevisiae 121 1-3在未添加半乳糖的发酵培养基中青蒿酸产量与原始菌株S.cerevisiae 1211在添加半乳糖的条件下相当,分别为1200 mg/L(摇瓶发酵)和20 g/L(中试发酵)。改造菌株S.cerevisiae 1211-3应用于工业生产有望将青蒿酸发酵成本降低10%～15%,具有较高的工业应用价值。本课题第二部分内容是与浙江震元药业合作,对一株高产制霉素的链霉菌Streptomyces sp.ZY01进行合成生物学改造。在前期对其次级代谢产物的研究中,已经确定了制霉素的一个未知组分RT6为环二肽类化合物-白诺氏菌素,是制霉素合成过程中的杂质组分,具有一定的细胞毒性,本研究目的是拟通过合成生物学手段去除该组分。通过基因组测序及生物信息学分析,推测RT6组分可能通过4个基因(albABCD基因簇)生物合成,albC基因为RT6组分合成过程中的限速及关键酶,因此本研究拟通过阻断功能基因albC及RT6生物合成基因簇,进而达到去除RT6无效组分的实验目的。但Streptomyces sp.ZY01对多种链霉菌常用抗生素(硫链丝菌素、安普霉素和卡那霉素)不敏感,我们发现其在含安普霉素的培养基中克隆生长呈现剂量依赖性的减少;通过温敏实验反复筛选,得到安普霉素敏感菌株。菌株的发酵结果表明:其次级代谢产物各组分产量与原始菌株无显著差异。随后我们选用携带安普霉素抗性基因的质粒pKCcas9dO,构建了一系列携带不同sgRNA的敲除质粒,并通过原生质体转化和接合转移将质粒转化进ZY01中进行albC基因及RT6生物合成基因簇的敲除。