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第一部分去细胞组织表面化学原位聚合法构建PEDOT人工套管支架中文摘要研究背景:周围神经损伤会导致长期、严重的功能障碍,其修复是公认的临床治疗难题之一。经典的神经缝合术和神经移植术均存在十分明显的治疗缺陷,寻求可靠的移植替代品是近年来周围神经损伤领域主要的研究方向。自体组织去细胞化支架由于可以保留细胞外机制的主要骨架成分,去除起主要致敏原性的细胞成分,是一种很有潜力的支架材料。聚3,4-乙烯二氧噻吩（poly 3,4-ethylenedioxythiophene,PEDOT）具有生物相容性好、导电性强的特点,是一种极具生物应用潜力的聚合材料。传统制备工艺多为电化学法,但化学聚合法更适合以生物体组织为底物进行制备。目的:本实验拟利用化学去细胞方法制备大鼠去细胞肌肉支架,随后采用化学聚合法,使EDOT单体在不易导电的去细胞组织表面原位聚合,制备新型去细胞-PEDOT神经套管支架,观察其大体及超微结构,测量产物中各化学成分,评估整个制备过程的生物安全性,为下一步应用于周围神经损伤的研究做好准备。方法:实验采用SD大鼠,获取大鼠股外侧肌肌肉组织,通过NaN3/SDS/TritonX-100化学去细胞方法获得去细胞组织支架。随后以FeC13为主体构建化学氧化法聚合体系,在去细胞组织支架表面进行EDOT单体原位聚合反应,共分为对照组（单纯去细胞支架组）,去细胞+PEDOT1组（仅进行单一循环聚合反应）和去细胞+PEDOT6组（进行6个循环聚合反应）。将获取到的各组产物支架,分别观察光镜下微结构和电镜下超微结构。利用X射线光电子能谱（XPS）技术检测产物支架表面各元素成分比例,判断化学反应后产物试剂残留情况。利用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测量产物组织深层铁元素总含量。应用排液法测定各组产物的孔隙率,应用四探针测试仪测量产物的电导率。结果:应用化学去细胞法成功获得去细胞肌肉组织支架,大体观呈乳白色,超微结构见复杂纤维束状结构,具备良好柔韧性。应用氧化法使EDOT单体在去细胞组织表面成功聚合为PEDOT多聚物,形成的去细胞-PEDOT支架大体观变为黑色,体积较聚合反应前有所缩小,硬度较前有所增加。超微结构见PEDOT聚合物不仅存在于去细胞组织表面,而且穿透进入组织超微结构中,形成黑色条索结构。去除细胞成分后的去细胞组织结构虽然仍保留有沿纤维方向纵向延伸的大概结构,但在各个方向上均具有各向异性的特点,因此在聚合反应后产物中也保留了各项异性的特性。通过各组间图像比较可见,随着聚合反应循环次数增多,PEDOT多聚物包裹层逐渐增厚。XPS能谱分析可知超声清洗后产物表面铁元素含量明显下降,大部分铁元素可能已经进入产物内部。元素分析结果确认铁元素主要在产物组织内部。孔隙率测定结果确认各组产物均具有超过85%的孔隙率,其中去细胞组织孔隙率最高,随聚合反应循环次数增多,孔隙率逐渐小幅下降。单纯去细胞组织电导率小于10-7数量级,PEDOT各组产物电导率均为10-4数量级,具备了传导生物电信号的基本条件。结论:本部分实验证实了应用化学去细胞法可以成功获得大鼠肌肉组织去细胞支架,在其表面应用化学氧化聚合法可以成功使EDOT原位聚合,获得去细胞-PEDOT复合支架。由于在制备过程中反复应用了超声清洗技术,通过XPS和元素分析技术证实铁元素等反应杂质在最终产物表面基本无明显残留,铁元素主要存在于支架结构内部,其释放量在动物体安全范围之内。孔隙率测定确认各组产物均具有极高的孔隙率,PEDOT各组产物电导率均为10-4数量级,可认为PEDOT聚合后各组产物具备传导人体内生物电信号的功能,符合其在周围神经领域应用的基本要求。因此这种去细胞-PEDOT复合支架具备了可以引导损伤后神经轴突增生修复的良好特性,为下一步周围神经损伤的研究做好了充足的准备工作。第二部分携带BMSCs的PEDOT人工套管支架对周围神经损伤的治疗研究及相关机制探讨研究背景:周围神经损伤会导致长期、严重的功能障碍,其修复是公认的临床治疗难题之一。经典的自体神经移植术由于神经来源有限,具有很大的使用局限。前期工作已经获得了具有生物应用性能的PEDOT神经导管。骨髓间充质干细胞（BMSC）具有向多种细胞分化的潜能,可以分化成对神经递质敏感的并具有神经电生理功能的类神经元细胞、神经胶质细胞等,同时还可以分泌多种促神经生长因子促进周围受损的髓鞘和神经纤维恢复。在相关机制研究中,微小RNA和Notch信号通路系统均为重要的研究热点。目的:本部分实验利用体内及体外动物实验确定自体BMSC填充PEDOT人工神经网络支架后BMSC的分化增生情况,评估其对周围神经损伤的治疗作用,探究Notch信号通路在BMSCs充填的PEDOT对外周神经损伤的作用。利用荧光定量PCR技术、western-blot技术结合细胞转染,检测BMSCs向神经细胞分化过程中相关因子（如:miR-21）的表达及Notch信号活性变化。最终探讨Notch信号通路在BMSC填充PEDOT人工神经网络支架后,大鼠神经损伤的程度以及修复程度,为该技术的下一步临床及基础研究提供参考。方法:实验采用SD大鼠,通过获取大鼠股骨及胫骨骨组织,通过标准方法获得骨髓细胞悬液,将其全部接种于25cm2细胞培养瓶中并将培养瓶置于37℃、体积比为5%C02、适宜湿度的培养箱中静置培养。45只雄性SD大鼠,在同一水平利刀切除一段坐骨神经造成8 mm缺损,而后随机分为3组并接受相应处理,其中:A组:对照组,实行假手术;B组:PEDOT人工神经网络支架;C组:PEDOT人工神经网络支架+ BMSCs。用BMSCs填充的PEDOT人工神经网络支架连接神经缺损处,规定时间后处死大鼠测量缺损神经的电信号传导恢复情况,同时观察BMSC在离体导管内的存活及分化情况。通过染色观察神经轴突及髓鞘再生情况,观察支架内及周围周围神经生长因子的分泌情况。利用荧光定量PCR、western-blot结合BMSCs向神经细胞分化诱导等方法,检测BMSCs向神经细胞分化过程中,相关分子miR-21表达情况及Notch信号通路相关蛋白Hes1和NICD的表达活性。随后,通过miR-21过表达/抑制,同时激活或抑制Notch信号途径等处理BMSCs,检测六种神经细胞标记分子（NSE,巢蛋白,GFAP,NF-M,MAP-2和β 3-微管蛋白）的表达变化,以及神经动作电位幅度、神经传导速度的变化。结果:A组（Control）坐骨神经外形正常,B组（PEDOT）神经断端可见局部膨大;C组（PEDOT+BMSCs）神经连接处无明显瘢痕形成,未见导管肿胀变性、吻合口断裂及神经瘤形成现象。肌电图检查结果显示,B组神经动作电位幅度和神经传导速度显著低于A组,而C组神经动作电位幅度和神经传导速度显著高于B组,接近A组水平。实时PCR结果证实,在BMSCs向神经细胞分化过程中,miR-21表达增加,Notch信号表达增强。过表达miR-21或激活Notch信号,均促进BMSCs向神经分化的能力,抑制Notch信号则逆转miR-21对BMSCs向神经细胞分化的促进效应;干扰miR-21则会抑制神经动作电位幅度和神经传导速度。结论:本项目证实了携带BMSC的PEDOT神经导管治疗周围神经损伤的可行性,在动物体内试验中可以对大鼠坐骨神经损伤后神经组织的修复产生明显促进作用;项目探究了 Notch信号通路在BMSCs充填的PEDOT对外周神经损伤的作用在BMSC向神经组织诱导分化过程中,miR-21和Notch信号的通路均为可能的重要促进机制。干扰或抑制二者的功能将显著影响神经功能的恢复。以上结果对PEDOT神经导管的下一步临床应用具有重要的借鉴价值。