第一部分 TFPI-2对中枢神经系统发育的影响和机制研究　　组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)是一种主要存在于细胞外基质(ECM)的丝氨酸蛋白酶抑制物，目前尚没有在整体水平对其生理功能和机制的研究。普遍认为它在组织发生、伤口愈合和肿瘤的侵袭转移等涉及到ECM重塑的生理和病理过程中发挥重要的作用。现有的研究也证实TFPI-2可以抑制多种肿瘤的侵袭转移，对动脉粥样硬化斑块的脱落也具有防止作用。目前尚不明确TFPI-2的具体生理功能，也未证实TFPI-2是否与大脑的发育有关。虽然人、牛、小鼠、大鼠、猿的TFPI-2基因已知，但是采用模式动物在整体水平研究TFPI-2基因功能的研究还未见报道，TFPI-2基因敲除动物的也未见开展。本课题应用斑马鱼下调模型和条件性敲除小鼠模型对TFPI-2的新功能和相关机制进行了研究和探索。　　之前，本课题组已经克隆了斑马鱼TFPI-2(zebrafish TFPI-2，zTFPI-2)基因，包括全部编码区和主要的5和3非翻译区，已提交GenBank，序列号为DQ395301。经过序列分析，发现zTFPI-2同样具有三个串联排列的Kunitz结构域，与人TFPI-2的三个结构域具有相似性。通过斑马鱼胚胎整体原位杂交技术(whole mount in situ hybridization，WISH)观察了zTFPI-2在斑马鱼胚胎发育过程中表达的时间和空间变化，发现zTFPI-2在斑马鱼胚胎发育的早期阶段就有明显表达，杂交信号主要位于胚胎的头部，提示zTFPI-2与斑马鱼中枢神经系统(central nervous system，CNS)发育可能有比较密切的关系。为了进一步探索TFPI-2在早期胚胎发育过程中的作用，我们进行了以下研究。　　首先，我们应用反义寡核苷酸和显微注射技术建立了斑马鱼TFPI-2下调模型。首先我们设计并合成了两种吗啡啉修饰的反义寡核苷酸(Morpholino，MO)，一种具有剪接抑制功能(KD-MO)，经过RT-PCR和测序的方法验证了该MO的有效性;另一种具有译阻滞功能(TB-MO)，通过与表达TFPI-2-EGFP融合蛋白的质粒共注射，验证了TB-MO的有效性。分别注射两种MOs，斑马鱼胚胎CNS表型相似。通过不同浓度梯度注射后胚胎表型统计，我们选取了最适注射浓度。同时，经过两种MOs低浓度共注射，CNS表型更为严重，说明二者具有协同作用。　　应用显微注射技术将两种MOs注射到斑马鱼受精卵后，我们观察到TFPI-2下调的斑马鱼胚胎出现CNS发育尤其是中后脑发育异常表型，并伴有色素细胞少、体形短、活动少和心包水肿等。这些表型在KD-MO与p53-MO共注射之后依然存在，且体外合成的TFPI-2 mRNA可以将其补救，说明了MOs下调该基因具有特异性。根据以上结果，我们推测TFPI-2对斑马鱼CNS发育具有重要调节作用。而这些TFPI-2缺陷表型与文献报道Notch信号通路被抑制后斑马鱼胚胎表型相似。通过基因芯片和Real-time PCR分析，发现TFPI-2下调后Notch信号通路信号分子her4、mib和Notch1a均有不同程度的下调。有趣的是，与TFPI-2mRNA一样，Notch通路中的信号分子her4 mRNA和mib mRNA也可以补救TFPI-2缺陷所致斑马鱼胚胎表型，使中枢神经系统异常表型减轻。　　通过Real-time PCR和WISH技术，及转基因斑马鱼的应用，我们发现下调zTFPI-2之后，神经元标志性基因HuC和前体神经元标志性基因ngn1表达升高，而神经胶质细胞标志性基因gfap和oligo2表达降低;转基因斑马鱼神经元(HuC-GFP)阳性细胞增多而神经胶质细胞(GFAP-GFP)阳性细胞减少。这与Notch信号通路受抑制后“旁侧通路机制”被干扰结果一致，既神经前体细胞向胶质细胞方向分化减弱，向神经元方向的分化加强。因此，我们推测Notch信号通路很可能参与了TFPI-2对斑马鱼中枢神系统发育的调控。　　为了核实TFPI-2影响中枢神经系统发育这一新功能，进一步探索TFPI-2通过怎样的机制与Notch信号通路相互作用，我们与上海南方模式动物中心合作，首次建立了TFPI-2 flox小鼠模型。将TFPI-2fl/-小鼠与Nestin-Cre转基因小鼠进行杂交，得到了在神经干细胞定向敲除TFPI-2的条件性敲除小鼠，为进一步研究TFPI-2生理功能和机制奠定了基础。　　第二部分 WDR62对斑马鱼心血管系统发育的影响和机制研究　　先天性圆锥动脉干畸形(CTD)是一类复杂性先天性心脏病(CHD)，其发病机制的研究已经成为该领域研究热点。我们前期通过全基因组外显子捕获与Solexa和SOLID二代高通量测序技术，我们获得了一批CTD新的突变基因。在查阅人类基因组数据库UCSC基因相关信息后，通过Primer3在线软件设计引物进行常规PCR扩增，我们应用Sanger测序对这些候选基因进行扩大样本验证。Mutation Surveyor软件进一步分析后，其中WD重复区域62(wdr62)引起了我们的关注。通过进一步全外显子测序分析，我们在wdr62外显子序列发现了多个新突变位点。　　WDR62是一个纺锤体相关蛋白，至少含有15个WD结构域，是WD重复蛋白家族成员之一但其具体功能尚不清楚。WD重复蛋白家族由许多结构相似、功能不同的调控蛋白质组成，参与信号转导、RNA转录和加工、蛋白运输等过程，尤其在细胞分裂早期染色体修饰中具有重要的作用。已有研究表明，wdr62基因突变与常染色体隐形先天性小脑畸形(Autosomal Recessive PrimaryMicrocephaly，MCPH)相关，又被称为MCPH2。wdr62基因在脑畸形病例中已发现多个突变位点，但至今未有该基因与先心病相关的报道。鉴于斑马鱼在CHD研究中的诸多优点，本部分应用斑马鱼模型进一步研究wdr62在胚胎发育，尤其是心血管发育过程中的影响极其机制。　　首先利用生物信息学的方法，我们发现各物种间WDR62序列具有同源性。在脊椎动物的进化过程中，WDR62结构和蛋白的功能结构域上相对保守。同时，我们对wdr62基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达谱进行了研究，RT-PCR和Real-time PCR结果显示，wdr62在斑马鱼胚胎早期(0.5～4 hpf)即有高表达，一直到成鱼都持续表达。此外，wdr62在肝、心、脑、鳃和眼等多个重要器官均有表达。　　我们设计了三个吗啡啉修饰的反义寡核苷酸:Ex2-MO、Ex8-MO和Ex26-MO。通过显微注射MOs干扰wdr62前体mRNA的转录，建立了wdr62基因表达下调的斑马鱼模型。首先，通过RT-PCR和克隆测序，分别验证了三个吗啉修饰的反义寡核苷酸的有效性。其次，三个MOs与p53-MO共注射后，通过表型和凋亡分析，证实了三个反义寡核苷酸的特异性。wdr62基因表达下调后，我们发现斑马鱼胚胎心脏出现结构和功能的异常表型，包括房室变大，心脏环化不全，红细胞严重减少，血细胞堆积，心脏搏动无力且有血液回流现象等。与原位杂交一致，电镜观察结果显示心肌纤维稀疏、分布无规则、肌小节变长。此外，wdr62基因表达下调的斑马鱼胚胎脑部发育也有明显改变，出现了脑体积变小和脑室水肿。电镜结果显示，脑灰质神经细胞内核糖体增加，白质神经纤维稀疏、减少甚至缺失。以上结果说明，在斑马鱼胚胎早期发育过程中，WDR62是心血管和脑部正常发育所必须的。　　为进一步研究wdr62在斑马鱼心脑发育过程中的作用和机制，我们分析了斑马鱼胚胎的细胞增殖和凋亡情况。免疫组化结果显示斑马鱼胚胎pH3和Ki67阳性细胞减少。而TUNEL和吖啶橙染色结果则显示凋亡细胞增多。推测下调后斑马鱼胚胎心血管和脑发育异常可能与细胞的增殖和凋亡调控失衡相关。　　根据以上研究，我们推测WDR62是斑马鱼早期正常发育所必须的关键因素之一。如果wdr62基因极其编码蛋白出现异常，会严重影响斑马鱼胚胎心血管和脑的发育。