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目的:从ADAM17角度探讨艾可清对HIV/AIDS患者HAART后炎症的影响,从调节炎症的角度寻找中医药干预艾滋病的新角度和新策略。方法:实验一。临床实验。东莞市人民医院123例HIV/AIDS患者签订知情同意书后纳入实验研究。将123名患者分为齐多夫定组(ZDV组)和替诺福韦组(TDV组)。ZDV组n=55,使用的联合高效抗逆转录病毒治疗(HAART)方案是ZDV+3TC(拉米夫定)+EFV(依非韦伦)/NVP(奈韦拉平);TDF组n=68,使用的HAART方案是TDF+3TC+EFV/NVP。123名患者抽取外周静脉血后,分装1ml在三个小时内送到实验室ELISA检测血浆sCD163和sCD14;余血常规检测血常规、病毒载量和CD4+T细胞计数。每组选14例(两组共28例)患者另外抽取5ml血液样本,一并在三个小时内送到实验室进行进一步检测:分离外周血单个核细胞、磁珠分离CD14+细胞,进一步用流式细胞术检测CD3、CD14、CD19、CD56、CD16、CD34、CD45、CD235a、HLA-DR、CD163;实时荧光定量PCR检测20种因子,包括CD163,趋化因子受体(CCR2,CCR5,CX3CR1,MCP-1和MIP-1β),其他参与免疫激活的细胞因子(HLA-DR和CD86),炎症因子(iNOS,HMOX-1,IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α)和代谢指标(ABCA1,ABCG1和PPARα/γ1/γ2/δ)。实验二。细胞实验。将人单核细胞THP-1培养在含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI1640培养基,置于条件为37℃、5%CO2的培养箱中。根据预实验的结果,取对数期细胞进行计数,按1x10~6个/ml的密度,加入1ug/ml的脂多糖(LPS)和浓度分别为6uM或者30uM的ZDV,LPS刺激THP-1细胞18小时,加入GolgiPlug继续培养6个小时。24小时后采集细胞,分别用Western Blot、免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测ADAM17,最后比较空白组、空白组+GolgiPlug(简称G)组、LPS组、LPS+G组、LPS+AZT(6um)组、LPS+AZT(30um)组、LPS+AZT(6um)+G组、LPS+AZT(30um)+G组共八组的结果。实验三。临床实验。广州市第八人民医院20例HIV/AIDS患者签订知情同意书后纳入实验研究。将20名患者分为两组,HAART组按照TDF+3TC(拉米夫定)+EFV(依非韦伦)/NVP(奈韦拉平)/LPV/r(利托那韦)的方案治疗,不服用艾可清;艾可清组按照HAART+中药艾可清免煎颗粒的方案治疗,HAART药物选用同HAART组。采集患者一般资料后,抽取外周静脉血,分装5ml在三个小时内送到实验室ELISA检测血浆sCD163、LPS;余血常规检测血常规、HIV-1病毒载量和CD4~+T细胞计数、CD8~+T细胞计数、肝功、肾功、血脂和血糖。按照实验设定的排除标准和剔除标准,实验结束时两组各有8名患者纳入统计。实验四。细胞实验。将人单核细胞THP-1培养在含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI1640培养基,置于条件为37℃、5%CO2的培养箱中。根据预实验的结果,取对数期细胞进行计数,按1x10~6个/ml的密度,加入1ug/ml的脂多糖(LPS)和浓度分别为2ug/ml、10ug/ml的艾可清。0.5小时和2小时后采集细胞,realtimePCR检测细胞因子CD163、ADAM17、IL-1β、IL-6、TNF-α,比较空白组、空白+LPS(0.5小时)组、空白+LPS(2小时)组、LPS+低剂量艾可清(0.5小时)组、LPS+低剂量艾可清(2小时)组、LPS+高剂量艾可清(0.5小时)组、LPS+高剂量艾可清(2小时)组共7组的结果。24孔板其余孔的细胞过夜后(12小时)收集细胞上清和细胞沉淀,ELISA检测上清中sCD163的表达;Western Blot检测细胞沉淀中ADAM17的表达,最后比较空白组、空白+LPS组、LPS+低剂量艾可清组、LPS+高剂量艾可清组共四组的结果。结果:实验一。临床实验。1、ZDV组和TDF组的贫血发生率差别不明显(P>0.05)。但是一系列与红细胞相关的血液学参数有显著差异。与TDF组相比,ZDV组的红细胞计数明显降低(P<0.01),平均红细胞体积(MCV)明显增大(P<0.01)。2、从28个病人血液中提取PBMC,流式细胞术证实ZDV组存在红细胞生成障碍。与TDF组相比,循环中的CD34+亚群在ZDV组显著降低(P<0.05),这证实了ZDV骨髓抑制的副作用。同时,ZDV组发现的红系祖细胞的比例高于TDF组(P<0.05),这提示红系祖细胞发育受损。3、ZDV组与TDF组的血浆sCD14水平无明显差异,但是ZDV组的sCD163水平明显低于TDF组(P<0.001)。sCD163水平与红细胞计数呈正相关,与MCV呈负相关,但是与血红蛋白浓度没有相关性。4、EFV/NVP对红细胞相关指标影响不显著。EFV/NVP对sCD163水平的影响明显弱于AZT/TDF(P=0.076),因此NVP/EFV与AZT/TDF对sCD163水平的协同作用无法得出明确结论。5、接受ZDV治疗的患者中间型单核细胞(CD14+CD16+)的比例明显高于接受TDF治疗的患者,经典型(CD14++CD16-)和非经典型(CD14low CD16+)单核细胞的比例差异不大。与TDF组相比,ZDV组细胞表面CD163表达明显增高,尤其在CD14++CD16-单核细胞表面表达(CD163+比例:P<0.01;CD163平均荧光强度:P<0.05)。在CD14++CD16+和CD14lowCD16+单核细胞表面表达的CD163没有组间差异。另外,sCD163水平和CD14++CD16-单核细胞表达的CD163比例呈负相关。6、实时定量PCR共检测了20种因子。在ZDV组和TDF组的纯化CD14+单核细胞中,有五种细胞因子表达有差异,分别是炎症因子iNOS和IL-6,趋化因子受体CX3CR1和MIP-1B,代谢指标PPARγ-1。实验二。细胞实验。1、蛋白印迹分析法:LPS刺激后两小时,所有组中的ADAM17都出现糖基化(120 kDa)。但是30μM AZT作用24小时后,糖基化的ADAM17显著减少。在GolgiPlug的协同作用下,糖基化的ADAM17条带显著减少并且被非糖基化条带取代。2、免疫细胞化学染色:与未经处理的细胞相比,经过30μM AZT处理的THP-1细胞表面表达ADAM17减少。3、流式细胞术:与未经处理的细胞相比,经过30μM AZT处理的THP-1细胞表面表达ADAM17减少。AZT可以增强GolgiPlug对ADAM17糖基化的抑制作用,但是检测显示THP-1细胞表面ADAM17的比例并没有降低。实验三。临床实验。1、HAART组与艾可清组在CD4~+T和CD8~+T淋巴细胞计数、肝功、肾功、血糖以及血脂方面的数据比较均无统计学差异(P>0.05)。2、ELISA检测HAART组与艾可清组的血浆LPS和sCD163的改变率均有统计学意义(P<0.05)。实验四。细胞实验。1、实时定量PCR:(1)IL-6:所有组与空白组都有统计学差异(P<0.05);空白+LPS(0.5小时)组与LPS+高剂量艾可清(0.5小时)组没有统计学意义(P>0.05);余比较均有统计学差异(P<0.05)。(2)IL-1β:所有组与空白组都有统计学差异(P<0.05);空白+LPS(2小时)组与LPS+高剂量艾可清(2小时)组没有统计学意义(P>0.05);余比较均有统计学差异(P<0.05)。(3)TNF-α:所有组与空白组都有统计学差异(P<0.05);空白+LPS(0.5小时)组与LPS+高剂量艾可清(0.5小时)组之间没有统计学意义(P>0.05);余比较均有统计学差异(P<0.05)。(4)ADAM17:所有组与空白组都有统计学差异(P<0.05);空白+LPS(0.5小时)组与LPS+高剂量艾可清+LPS(0.5小时)组之间没有统计学意义(P>0.05);空白+LPS(2小时)组与LPS+高剂量艾可清+LPS(2小时)组之间没有统计学意义(P>0.05);余比较均有统计学差异(P<0.05)。(5)CD163:所有组与空白组都有统计学差异(P<0.05);空白+LPS(2小时)组与LPS+高剂量艾可清(2小时)组没有统计学意义(P>0.05);余比较均有统计学差异(P<0.05)。2、ELISA检测sCD163:各组之间均有统计学意义(P<0.05)。3、WesternBlot检测ADAM17:与空白组和LPS+空白组相比,2ug/ml艾可清作用12小时后,ADAM17明显受到抑制,10ug/ml艾可清也可以抑制ADAM17糖基化,但是效果不如低浓度艾可清明显。结论:1、临床实验。ZDV和TDF通过调控单核/巨噬细胞系CD163的脱落来不同的影响sCD163水平。与TDF组相比,ZDV组患者的外周血CD14细胞中有较低水平的CD163脱落和较高水平的增殖和活化。2、细胞实验。ZDV可以减少被LPS刺激的THP-1细胞表面表达ADAM17,抑制ADAM17糖基化。3、临床实验。艾可清与HAART联用能减少血浆中LPS和sCD163的表达。4、细胞实验。艾可清对ADAM17有抑制作用,减少被LPS刺激的THP-1细胞表面IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达,减少CD163脱落。