当前,代谢工程和合成生物学的大量工作仍是基于质粒系统在进行,质粒系统操作在实验室是可行的,但不适于工业化的大规模应用。这主要是因为质粒系统一般需要外界压力的维持,而且存在着结构不稳定性和遗传不稳定性的缺陷。与之相对应的是基因组插入方法。在当前的大量基因组插入方法的报导中,单拷贝基因整合仍是主流。但单拷贝基因整合往往造成目的产物产量水平的下降。因此基因的多拷贝整合及相关方法引起了人们的关注。但现有在细菌中进行基因多拷贝整合的报导存在不足,这主要是由于在细菌中报道的多拷贝整合方法只能在同源重组缺陷的RecA-的菌株中进行,但RecA-菌株往往生长迟缓,鲁棒性差,这一点严重限制了这类方法在工业化过程中的应用。我们实验室开发了一种借助Tn5体外转座体方法,实现了多次多拷贝多位点外源DNA的基因组整合,可以在多轮重复的操作下,在具有同源重组能力的RecA+的大肠杆菌中完成基因组的多拷贝插入。但该方法也存在很多不足:比如每次转座后获得的克隆数较少,实验结果不稳定,并且操作复杂。这些不足不利于本方法的大规模工业化应用。在以上工作的基础上,我们在本论文中提出了两种新策略来完成含有外源DNA多拷贝整合到具有重组能力的RecA+大肠杆菌基因组中,既可以实现多次多位点多拷贝整合也可以实现一次性的多拷贝多位点整合。1.借助电转化和体内转座实现了多次多拷贝多位点基因组整合;我们首先构建了 pKD46::Ptrc-TnpA,使Tn5转座酶的基因受IPTG诱导的Ptrc启动子控制;将两端含有ME位点的并且5’端被磷酸化的ME-FRT-Kan-FRT-Ptrc-eGFP-ME的DNA片段导入到表达了转座酶的细菌中,结果证明片段可以被成功整合到了大肠杆菌基因组上,但该方法的效率不高。为了提高效率,我们进一步将被ME位点包裹的ME-FRT-Kan-FRT-Ptrc-eGFP-ME的DNA片段构建在了以含R6K复制子的质粒上,将质粒作为Tn5转座酶的底物,仍采用电转化的方法转入到大肠杆菌中,因为普通大肠杆菌缺乏pir蛋白,无法识别R6K复制子,无法维持质粒复制,所以必须借助Tn5转座酶介导转座,将抗性基因连同外源DNA一起插入到细菌的基因组上才能使得细菌具有相应的抗生素抗性,结果发现相较于片段,借助这种方法将ME位点包含的片段转入细菌基因组的概率提高了 10倍以上,并且结果稳定。利用这种方法,我们成功的将Ptrc-eGFP片段引入到了大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经过多轮的操作,最高达到3个拷贝;利用这种方法我们还将PHB合成基因簇(7.2kb)也插入到了 BL21(DE3)中,并使得其生成了占细胞干重1.5%左右的PHB。此外,我们还想构建单质粒“mini-Tn5”系统,即将Tn5转座酶和其识别的ME包裹的序列区构建在一个质粒上,最终未将质粒构建成功。这进一步表明,我们当前所建立的方法相较于已报道的单质粒“mini-Tn5”方法,稳定性更好。2.借助接合转移实现了单次多拷贝基因组整合的方法在本部分,我们又在之前的工作基础上,成功建立了一种可以在大肠杆菌中一次性插入多拷贝外源DNA片段的方法。我们发现,接合转移的方法可以将转座发生的概率提高100倍。但之后我们发现S17-1λpir菌株的假阳性较高(约1%),原因是供体菌的pir蛋白出现在了受体菌中,导致供体菌的质粒在受体菌中复制,该工作说明S17-1λpir不适合于进行一次性高拷贝的插入工作。我们找到了 MFDpir来替换S17-1λpir菌株作为供体菌,该工作显著降低了供体菌质粒在受体菌中复制的概率,基本上没有筛选到假阳性的插入。之后,我们进一步对抗生素基因进行了筛选,据报道Tricloson(三氯生),Cmr(氯霉素)和Kan(卡那霉素)这三种抗生素都有潜力通过抗生素浓度梯度来筛选不同拷贝的抗生素基因,因此我们构建了含有相应抗生素标记的菌株。但结果发现,这些抗性中,只有Kan表现出了预期的效果,因此Kan被选出用于进一步的实验。我们比较了电转化和接合转移这两种引入DNA的方式,分别通过两种方式来引入含ME位点的质粒到表达Tn5转座酶的细胞中,结果发现只有通过接合转移可以形成抗高浓度kan抗生素的菌落,这表明接合转移这种介导DNA进入细胞的方式更优。利用这种方法,我们分别成功的一次性的向RecA-的XL-1 Blue MRF’和RecA+的MG1655菌株中转入了最高为5和8个拷贝的目的DNA片段。本论文借助Tn5转座并结合不同的转化/转移方法,从头构建相关质粒,对过程进行优化,最终成功的得到了两种新的在大肠杆菌中构建多拷贝整合基因组的方法。据我们所知,该方法是唯一适用于在RecA+的大肠杆菌中使用的基因组整合方法,具有很好的工业化应用潜质。