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第一部分:右归丸对EAE小鼠神经导向因子及Rho GTP酶信号分子的调节作用目的:观察右归丸对小鼠脑和脊髓netrin1/DCC、slit2/Robo1和Rho A/Rac1/Cdc42等神经因子的调节作用,以探讨右归丸促进实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠神经再生的作用机制。方法:70只C57BL/6雌性小鼠,随机分为七组,分别为正常组(NC)、模型组(MO)、激素组(PA)、梓醇组(CA)和右归丸组(1.2,2.4,4.8 g/kg)。皮下注射MOG35-55建立EAE小鼠模型。每日灌胃给药,记录体重和神经功能评分。40天后处死小鼠,取脑和脊髓,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色光镜观察小鼠脑和脊髓组织病理改变,透射电镜观察小鼠脑和脊髓轴突和髓鞘的损伤变化。免疫荧光法(immunofluorescent staining,IF)观察MAP-2的表达。免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot,WB)检测小鼠脑和脊髓netrin1、DCC、slit2、Robo1、Rho A、Rac1和Cdc42的表达水平。结果:右归丸能减低EAE小鼠的神经功能评分、减轻脑和脊髓炎性细胞浸润、减少轴突损伤和髓鞘脱失。右归丸可提高MAP-2的表达。IHC、q RT-PCR和WB显示,右归丸可提高netrin1、DCC、slit2、Robo1、Rac1、Cdc42的表达水平,降低Rho A的表达水平。结论:右归丸对MOG35–55诱导的EAE小鼠具有一定的神经保护作用,能促进神经再生修复,该作用与调节netrin1/DCC、slit2/Robo1和Rho家族Rho A、Rac1、Cdc42相关。酶信号分子的调节作用第二部分:右归丸及其滋阴、温阳拆方对EAE小鼠神经导向因子及Rho GTP目的:进一步研究右归丸“阴中求阳”配伍对EAE小鼠神经再生的调节作用。方法:C57BL/6雌性小鼠分为NC、MO、PA、CA、右归丸(YGPs)、滋阴填精方(NY)和温阳化气方(WY)七组。造模和处理方法同实验第一部分,检测指标和方法亦同前。结果:右归丸及其NY、WY拆方均能减低EAE小鼠的神经功能评分、减轻脑和脊髓中的炎性细胞浸润、缓解轴突损伤和髓鞘脱失。右归丸及其拆方可提高MAP-2表达,IHC、q RT-PCR和WB结果显示,右归丸及其拆方可提高netrin1、DCC、slit2、Robo1、Rac1、Cdc42的表达水平,降低Rho A表达水平。在拆方研究中,NY在减轻EAE小鼠急性期神经功能评分以及EAE缓解期病理损伤效果较好,对EAE缓解期排斥性导向因子slit2、Robo1以及信号分子Rho A具有调节作用;WY对EAE缓解期吸引性神经导向因子netrin1、DCC以及信号分子Rho A、Rac1、Cdc42具有调节作用,而右归丸方对上述各方面均具有较显著的调节作用。结论:右归丸方及其拆方均对EAE小鼠有神经保护作用,可通过调节slit2/Robo1、netrin1/DCC和Rho A/Racl/Cdc42促进EAE小鼠神经修复。滋阴和温阳拆方在神经保护和神经修复等方面各有侧重,右归丸在神经保护和神经修复等方面均具有较为显著的调节作用。第三部分:右归丸方及其滋阴、温阳拆方的主要化学成分指认与定量分析目的:为右归丸方及两个拆方的质量控制与发挥作用的物质基础提供依据。方法:采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS对右归丸方及其拆方的化学成分进行研究,应用LC-ESI-MS/MS法对右归丸样品中的马钱苷与金丝桃苷进行定量测定。结果:本研究从右归丸方中指认出宋果灵、绿原酸、附子灵、马钱苷、尼奥灵、獐牙菜苷、金丝桃苷、槲皮素8个化合物;滋阴方中主含绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、金丝桃苷、槲皮素等5个化合物,温阳方中主含宋果灵、绿原酸、附子灵、尼奥灵、金丝桃苷、槲皮素等6个化合物。定量测定右归丸方中马钱苷的含量是51.8 mg/g,金丝桃苷的含量是43 mg/g。结论:右归丸方及其滋阴、温阳拆方的化学成分指认及主要化学成分含量测定为药理实验提供了质量控制及相应的作用物质基础。综上,本课题研究证实右归丸对EAE小鼠具有明显的神经保护作用,能够促进EAE小鼠神经修复,其作用机制可能与调节神经导向因子netrin1、slit2和其受体DCC、Robo1,以及细胞内Rho GTP酶Rho A、Rac1、Cdc42相关。滋阴、温阳拆方作用各有侧重,全方在神经保护和神经再生等方面均具有较为显著的作用,揭示了右归丸“阴中求阳”配伍的部分科学内涵。