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磷是植物生长发育所必需的大量营养元素。油菜是我国重要的油料作物,需磷较多,对缺磷敏感。本课题分析了油菜中细胞分裂素响应因子(cytokinin response factor,CRF)家族基因的基本特征,然后以前期在RNA-seq研究中发现的受缺磷强烈诱导表达的4个CRF家族基因BnaCRF8s为目标基因,以磷高效品种鄂油长荚为材料,分离克隆了BnaCRF8s的全长及cDNA序列,通过生物信息学分析、基因时空表达模式分析、亚细胞定位及转化拟南芥等手段研究了基因的功能,初步揭示了BnaCRF8s基因参与甘蓝型油菜体内磷稳态的分子机理。主要研究结果如下:1、甘蓝型油菜CRF家族基因的家族特征分析利用已公布的甘蓝型油菜全基因组序列信息,通过甘蓝型油菜基因组数据库的blast功能,以同时含有AP2/ERF和CRF两个保守结构域为条件,查找了拟南芥CRF家族基因在甘蓝型油菜中的所有同源基因,最终找到36个油菜CRF家族基因。分析发现油菜CRF家族成员分布在除A04、A10和C09以外的16条染色体上,基因的全长从495 bp到1117 bp,编码的氨基酸大小从164到362,除4个基因外均含有一个外显子。系统进化分析表明BnaCRFs家族基因可以分为3组。基因结构分析显示该家族基因均含有AP2/ERF保守结构域和CRF保守结构域。进一步对蛋白的理化性质及结构进行分析发现该基因家族蛋白均为稳定、亲水性、部分无序蛋白,且都不是分泌蛋白和转运蛋白,都定位在细胞核上并行使调控作用。2、甘蓝型油菜BnaCRF8s基因的分离克隆与进化分析利用实验室已有的油菜在低磷和正常磷条件下的RNA-seq数据,分析BnaCRFs家族基因表达谱,发现4个BnaCRF8s(BnaC2.CRF8、BnaA2.CRF8、BnaCn.CRF8和BnaA7.CRF8)的表达丰度及低磷诱导程度均显著高于其他家族成员。因此,以磷高效甘蓝型油菜品种鄂油长荚为材料,分离了BnaCRF8s基因的全长及cDNA序列。分析发现4个基因只含有1个外显子,基因序列同源性高达90.39%,氨基酸序列的相似性为89.64%。进化分析发现来自油菜A基因组的基因(BraA2.CRF8及BraA7.CRF8)及来自油菜C基因组的基因(BnaC2.CRF8及BnaCn.CRF8)分别与来自白菜A基因组上的同源基因及来自甘蓝C基因组上的同源基因聚在一类。3、甘蓝型油菜BnaCRF8s基因的功能初步研究分析了磷正常和缺磷水平下4个BnaCRF8s基因在油菜苗期地上部和根系中的表达模式,结果表明缺磷胁迫显著诱导了4个基因在2个部位中的表达。同时基因的表达量随着缺磷时间的延长而逐渐上升,在恢复供磷后恢复至正常水平。对磷正常和缺磷水平下油菜成熟期花蕾、荚果柄、荚果壳和种子等组织器官中的基因表达水平下进行分析,发现缺磷条件下荚果柄中4个BnaCRF8s基因的表达量均显著高于磷正常条件;荚果皮和花蕾中,4个BnaCRF8s基因的表达量均显著低于磷正常条件下基因的表达量;种子中,除了BnaA2.CRF8的表达量显著低于磷正常条件下的表达量以外,其余三个BnaCRF8s基因都与磷正常条件下的表达量没有明显差异。亚细胞定位结果表明BnaC2.CRF8蛋白位于细胞核上。将油菜的BnaCRF8s基因在拟南芥中进行超量表达,结果发现与野生型相比,转基因材料的地上部与根部都受到了显著的抑制,生物量显著下降,推测BnaCRF8s为磷信号网络中的负调控因子。