抗生素的广泛和不恰当使用,使微生物特别是病原微生物,在强大的抗生素选择压力下,演化出许多不同的耐药机制,导致各种病原菌的耐药问题越来越严重。耐药性可通过食物链或各类环境介质所传递,其中水环境被认为是抗性细菌和抗性基因的“储存库”,其包括饮用水途径或海水浴场娱乐活动。海水浴场承载了大量的游客,由于雨水冲刷或涨潮落潮引入了人源及动物源粪便,进而对浴场海水造成了环境污染。粪便通常携带了大量的大肠杆菌,其中致病性大肠杆菌可通过海水吞咽引发游泳人群致命性肠道疾病。而随着抗生素的广泛使用,海水浴场中耐药性大肠杆菌数目也逐步增加。耐药性大肠杆菌携带的抗性基因可通过自身基因突变或抗性基因水平传播在不同种属细菌之间传递。因此,调查研究海水浴场大肠杆菌耐药性具有重要的公共卫生意义。本研究在细菌耐药性日益严重的现状下,采用微生物及分子生物学方法,开展了对浴场抗性及抗性基因的研究工作,最终得到的主要研究内容和研究结果如下:1、本研究选取大连星海浴场为代表浴场,通过药敏实验分析了海水浴场中大肠杆菌的耐药性状况。对从海水中分离出的138株疑似大肠杆菌进行生理生化鉴定发现41株为大肠杆菌,并采用K-B纸片法测定了其对9种常见抗生素的耐药性。药敏实验结果显示,受试菌株对四环素的耐药率高达46.3%,这跟四环素在我国使用时间早,使用领域广泛有关,而氨曲南仅为4.9%,氨曲南的临床使用相对较少,在药物使用的选择压力下,反映为抗生素的耐药率相对较低。星海浴场海水中大肠杆菌的耐药率为65.9%,其中34%的大肠杆菌对3种及其以上的抗生素表现出抗性。上述结果表明大连星海浴场中大肠杆菌的多重耐药状况严重。2、以试验菌株的基因组及质粒DNA为模板,通过对四环素抗性基因PCR检测,实验结果中四环素阳性菌株表现出耐药性的比率分别为68%和84%,均较高,将四环素阳性菌株数与四环素耐药菌株数进行χ2检验,发现四环素阳性菌株中的耐四环素菌株数显著高于四环素阴性菌株,表明大肠杆菌的四环素耐药性与四环素抗性基因阳性检出率相关。其中四环素抗性基因tet A的检出率最高,其次tet B,其它四环素抗性基因未检出。推测大肠杆菌耐药性,可能主要由tet A基因传递。实验中检测到部分四环素敏感菌株亦含有抗性基因,推测其可能原因为其携带但未表达。3、本研究中41株分离自星海浴场水样中的大肠杆菌,整合酶基因检测PCR结果中,41株分离菌株中,有14株为多重耐药菌株,多重耐药率为34%,至少对三种抗生素耐药的整合酶阳性菌株均占比例较高,分别为83.3%和80%。将整合子阳性菌株数与多重耐药菌株数进行χ2检验,发现整合子阳性菌株的多重耐药率显著高于整合子阴性菌株,表明大肠杆菌的多重耐药性与整合子阳性检出率相关。单个菌株携带的耐药基因与耐药表型之间并无完全对应关系,但整合子在耐药菌株之间的分布相对来说比较集中。4、整合子可变区扩增结果中,整合酶基因的PCR扩增阳性率比整合子可变区的PCR扩增阳性率高。分析原因可能是整合子的5′或3′端保守序列中有大的插入序列,造成5’CS或3’CD引物相应序列的缺失,不能得到扩增引物。整合子可变区测序结果显示整合子内部插入磺胺类耐药基因二氢叶酸还原酶基(dfr Al/12/17)和氨基糖苷类耐药基因核苷转移酶基因(aad Al/2/5),比较之前的药敏实验结果,得到被测菌株对氨基糖苷类的链霉素、庆大霉素和磺胺类的复方新诺明都表现出较高的耐药率,这与细菌基因组DNA和质粒DNA上的整合子可变区携带了这两类药物的耐药基因表现出了高度的相关性,说明I类整合子携带的基因盒在介导大肠杆菌对氨基糖苷类和磺胺类药物的耐药性中发挥了重要作用。另外发现,在染色体和质粒上所携带的基因盒大小相同。提示耐药基因可能已经通过整合子在质粒、染色体和染色体之间转移及积聚重排,造成大肠杆菌中的整合子所含耐药基因在水平和垂直方向传播。国内外均有研究证实了这点。整合子中的基因盒dfr、aad A有很高的同源性,因为这些基因盒频繁的出现在同一个整合子上。