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miRNA是近几年发现的对基因表达进行转录后调控的小分子RNA,研究证实其参与脂肪组织发育相关的许多生物学过程调控。至今,有关猪脂肪组织发育过程表达的所有miRNA尚没有确定。所以,为全面理解猪脂肪组织发育过程miRNA的调控功能,本研究构建了7日龄和240日龄荣昌猪背部皮下脂肪组织小RNA文库,采用Solexa测序技术检测了两个阶段脂肪组织中miRNA的表达谱,鉴定了脂肪组织发育相关miRNA,并对这些miRNA的表达情况和潜在功能进行了全面分析和预测。猪miR-103最初是通过序列相似性搜索被鉴定的。至今该分子在猪上的功能还没有报道。为全面了解猪miR-103的生物学功能,我们首先检测了猪正常组织中miR-103的表达谱,计算了miR-103预测靶基因的GO term富集度;然后我们整合两者结果全面分析了猪miR-103的潜在生物学功能;最后在猪前体脂肪细胞上验证了miR-103对脂肪细胞分化的影响和可能机制。上述研究获得以下主要结果:1.由7日龄和240日龄2个脂肪组织小RNA文库分别获得高质量序列读数12,643,158和9,623,166,其中绝大多数序列长度为22nt,与miRNA的一般大小相一致。去除冗余序列后,由两个文库共获得长度为18-30nt的纯净序列读数21,632,536,其中小猪和大猪脂肪组织小RNA文库中纯净序列种类数分别为149,957和270,913,两文库间共有序列种类为39,522。分类注释显示,小猪和大猪文库中与已知miRNA匹配的序列数分别为75.22%和63.86%,未被注释序列数分别为23.26%和28.1%。2.从两个文库中共鉴定到猪保守miRNA 227种,其中151种已在miRBase(15.0)中注释,17种先前已有报道,59种为新鉴定的。序列分析显示,在猪脂肪组织中多数miRNA存在长度和序列变异,一些miRNA种子区序列常常存在碱基编辑现象。对所鉴定的227种miRNA进行基因组定位,共预测到214个基因组序列,能够形成稳定的miRNA前体二级发卡结构。3.基于miRNA生物发生标准,共鉴定到78个小RNA形成位点序列能折叠形成茎环结构,这些序列可产生66种新的猪候选miRNA。这些新的miRNA在小猪和/或大猪脂肪组织中的绝对测序频率均很低。另外,这些新miRNA的序列长度变异范围在18-23nt间,且以21nt为最多;5′末端碱基以尿嘧啶(U)为主。4.对所鉴定的227种miRNA的表达分析结果显示:201种miRNAs在两个发育阶段脂肪组织中共表达,19种仅在7日龄脂肪组织表达,7种仅在240日龄脂肪组织表达。其中,201种共表达miRNA中有93种的表达在240日龄脂肪组织中被显著上调,33种被显著下调。不同miRNA间表达丰度变异范围较大,从几个读数到几百万读数不等。5.对猪脂肪组织发育过程15种最高丰度miRNA的2149种预测靶基因进行了生物信息学分析。KEGG通路分析显示,预测靶基因在脂肪形成相关通路、细胞生物学过程相关通路和神经发育相关通路3大方面显著富集。脂类代谢相关靶基因分层富集显示,与脂肪酸生物合成过程相关靶基因的GO term富集度最高。6.组织表达谱结果显示,在所分析的13种组织中miR-103均有表达,但表达丰度存在较大差异。到大猪阶段,miR-103在大脑、肝脏和脾脏中呈组织特异性表达。7.对miR-103的225个预测靶基因进行了分层富集,结果显示靶基因GO Term在细胞过程、发育过程、多细胞生物形态发生、代谢过程和生物学过程调节等5大功能范畴显著富集。尤其是与神经系统发育相关靶基因的高度富集对miR-103来说是高度特异的。8.基于组织表达谱和靶基因分析至少可以确定,miR-103参与脂类代谢和脂肪细胞分化、神经系统发育、红细胞生成和免疫调节。9.正常情况下,miR-103在猪前体脂肪细胞分化过程表达水平被上调5-9倍。当miR-103反义抑制后,可明显降低猪前体脂肪细胞分化早期阶段脂肪生成标志基因C/EBPα、PPARα、PPARγ的表达和甘油三酯的蓄积;同时使潜在靶基因维甲酸诱导14(RAI14)的mRNA和蛋白表达水平均上调。这些结果表明,正常情况下miR-103可促进猪前体脂肪细胞分化,该作用可能部分是通过靶作用于RAI14实现的。总之,本研究拓展了猪已知miRNA的数量,获得了对猪脂肪组织发育过程miRNA转录谱的全面洞察。同时,也提供了对miR-103生物学功能的全面认识。