颈椎根性疾病相关痛(cervical radicularpathy pain,CRP)是现代高压力办公室工作带来的越发普遍的职业性疾病,严重影响人们生活质量并且具有自发性加重的特点。与腰背痛相比,CRP患者并无承重障碍的症状,而97.5%患者是以慢性疼痛原因就诊,包括长期自发性疼痛、肢体放散性疼痛,以及转动压迫颈椎椎骨关节引起的“闪电样”剧痛。由于动物颈椎椎骨关节解剖位置深,颈部神经丛交叉和分支多,动物颈椎部位手术难度大,一直缺乏模拟颈部病变的动物模型,CRP动物痛觉行为学难以观察。目前对于颈部外周神经病理性痛的发生发展机制尚不清楚。我们研究室前期建立腰背神经病理性痛大鼠模型,在体研究发现在此模型上外周损伤背根神经节(dorsol root ganglion,DRG)产生异常自发放电(spontaneous activity,SA)。在生理状态下DRG神经元少见,相反在慢性痛条件下DRG神经元呈现出大量异位SA。研究表明在单纤维记录实验中,表达与外周神经系统SA的纤维的传导速度多为A类有髓纤维,而极少有C类无髓纤维参与介导CCD模型中SA。DRG离体研究表明,损伤DRG神经元SA起源可能依赖于神经元的阈下膜电位振荡(subthreshold membrane potential oscillation,SMPO),而具有SMPO神经元往往伴随胞膜上离子通道激活及失活的改变表现出细胞膜内在性质的变化。因此,在病理性痛模型中初级感觉DRG神经元常常表现出异常细胞膜特性。兴奋的外周神经向脊髓痛觉感受区传递大量增加的痛觉传入将引起脊髓第一级突触的可塑性改变,形态学研究表明,在慢性痛条件下DRG神经元敏化伴随外周神经系统和脊髓背角神经终末上一系列激活基因表达的变化。但是对于CRP情况下DRG神经元如何发生改变及其机制尚不甚明了。以往研究表明,DRG神经元机械感觉功能参与机械痛敏。但是DRG感觉神经元有不同亚型神经元组成,承担不同感觉功能。机械敏感的神经元较不敏感神经元更易被机械性刺激造成损伤。但是目前缺乏针对疼痛模型特异DRG神经元的分类观察,外周慢性痛机制中各细胞和分子靶点也不明确。在本课题第一部分中,我们研究结果如下:(1)建立模拟临床CRP症状的大鼠模型,明确CRP模型大鼠痛行为学特征;(2)CRP大鼠模型DRG感觉神经元进行各亚型分类的电生理指标研究,找出CRP相关的重要细胞和分子靶点。首先,我们在大鼠颈椎C7/C8椎间孔,通过插入“L型”钢柱的手术,形成DRG稳定的慢性压迫损伤,模拟椎间盘疝出或椎骨关节狭窄的病理学特点。结果表明,CRP模型组动物较假手术组在术后1天就出现了双侧前足缩足痛阈明显下降。在术后4天达到最大值,并一直持续到手术后四周。接着我们观察了CRP模型动物表现的热痛敏,通过使用热光源对动物双侧前足足底皮肤造成伤害性热刺激。结果表明CRP模型动物在术后第3天出现上肢痛觉潜伏期明显缩短,但较温和。热痛缩足潜伏期的缩短可以持续到术后4周。同时,我们观察CRP动物的自发痛行为。自发痛行为测定为在一分钟内动物表现对患侧上肢体抓咬舔时间。CRP模型动物在术后1天就表现出较假手术组动物明显增加的患侧肢体的自发痛行为。在一周内达到最大值,在术后两周后自发痛行为时间缓慢下降。免疫组织化学结果表明,在CRP模型术后12小时C7和C8压迫侧DRG上表达c-Fos蛋白的神经元比例明显增加,在术后24小时达到最大值,在48小时后依然有明显区别。而在脊髓背角浅层,在DRG损伤12小时后,表达c-Fos蛋白的脊髓神经元也大量增加,在CRP模型术后24小时达到最大值,在48小时组仍然与假手术组有明显差异。研究提示,脊髓痛觉感觉神经元c-Fos蛋白表达的升高与DRG神经元的变化趋势一致。为了重复验证c-Fos蛋白的结果,我们观察CRP模型动物在5术后24小时后DRG和脊髓神经元磷酸化胞外信号相关激酶(Extracellular signal-related kinase,ERK)的表达。结果表明,在术后24小时,p ERK1/2在患侧DRG和脊髓神经元的表达都较假手术组明显升高。结果表明在CRP大鼠模型上,损伤DRG神经元早期激活,感觉神经元异常兴奋,向中枢神经系统痛觉感觉区传入增加引起脊髓背角感觉神经元兴奋,痛觉传导通路激活。DRG神经元分成Aβ大神经元,IB4~-Aδ小神经元、IB4~-和 IB4~+C类神经元。IB4~-Aδ小神经元明显较其他DRG小神经元更加兴奋。并且被认为介导自发痛行为的异常SA高度表达在IB4~-Aδ小神经元,而在CRP模型组的C-神经元没有出现任何自发电活动。IB4~-Aδ小神经元的SA与动作电位幅度一致,并且在记录中可以稳定持续发放两小时以上。结果提示CRP模型IB4~-Aδ小神经元表现明显SA。以往研究认为,IB4~-AδDRG神经元以其特殊的细胞膜柔韧机械特性介导外周的机械性触觉。在本课题的第二部分中,我们研究发现:(1)在CRP模型中IB4~-Aδ神经元的机械敏感特性;(2)介导DRG神经元机械敏感特性的离子通道机制;(3)CRP模型机械性痛觉过敏的外周镇痛靶点。我们使用微操作器在全细胞钳制的DRG的IB4~-AδDRG神经元胞体表面直接给予机械压力刺激(mechanical stimuli,MS),刺激强度控制在不对细胞膜造成任何伤害。结果表明,对照组观察到MS后出现的神经元放电。而在CRP组同样的MS刺激引起超高频的神经元放电活动,高频MS放电频率较SA频率升高10倍。IB4~-DRG神经元在刺激后仍可以维持长时间的高频放电水平。离子通道机制研究表明,在CRP模型组IB4~-Aδ神经元超极化激活的环核苷酸门控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)通道表达的Ih电流密度明显增加,这可能是CRP模型动物发生疼痛行为学改变和DRG、脊髓出现形态学改变的机制。CRP模型并未改变IB4~-的Aδ神经元的Ih电流反转电位。HCN通道蛋白和IB4双标荧光结果验证,HCN1和HCN3亚型在CRP模型后在IB4~-DRG神经元中表达升高,而HCN2亚型没有明显改变。HCN通道的特异性阻断剂ZD7288可以阻断CRP模型组IB4~-Aδ神经元包括SA、MS引起的高频放电的超兴奋性电活动,而对正常动作电位产生无影响。鞘内注射ZD7288组较生理盐水组反转了70%CRP模型引起的动物反射性缩足阈值的下降。而在热痛检测中ZD7288未见有明显改善热痛缩足潜伏期的效果。在自发痛行为检测中,ZD7288组较生理盐水组明显减少CRP模型动物的自发疼痛行为,单次给药镇痛作用超过12小时。上述结果表明,IB4~-Aδ神经元上HCN1和HCN3亚型高表达是CRP介导神经元超兴奋性改变的离子通道基础。ZD7288抑制CRP DRG神经元超兴奋性而不影响正常感觉神经元生理功能,为CRP治疗提供新的策略。