论文部分内容阅读
小鹅瘟是由鹅细小病毒(GPV)引起的一种急性或亚急性传染病,1~2周龄雏鹅死亡率高达90~100%,严重危害养鹅业的健康发展。GPV是细小病毒科的重要成员,VP3蛋白是构成病毒衣壳的主要结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体。因此,VP3蛋白成为小鹅瘟基因工程疫苗研制的首选靶蛋白。本研究通过PCR方法扩增GPV的VP3基因,将其重组至腺病毒载体,在体外包装成能够高效表达VP3蛋白的重组腺病毒,并观察其免疫原性,旨在为研究GPV重组活载体疫苗奠定基础。(1)VP3基因的重组穿梭质粒的构建:以p DC-VP3重组质粒为模板,采用PCR方法扩增获得长度为1605 bp的VP3基因,并将其克隆至穿梭质粒pac Ad5 CMV K-Np A,获得重组穿梭质粒pac Ad-VP3。(2)VP3重组腺病毒的构建:经Pac I线性化的pac Ad-VP3及骨架质粒pac Ad59.2-100在脂质体介导下共转染HEK293AD细胞,获得重组腺病毒rAd-VP3。rAd-VP3连续传代至F6代,病毒效价可达10-8.23/0.1 m L TCID50。(3)rAd-VP3的鉴定:用RT-PCR可从rAd-VP3扩增到长度1605 bp的DNA片段;用Western blot在rAd-VP3感染的HEK293AD细胞培养物检测到分子量大小约57 k D的特异性蛋白条带,该蛋白可与GPV抗血清特异性结合;用rAd-VP3感染的HEK293AD细胞和鹅胚成纤维细胞(GEF)经GPV抗血清和荧光标记的山羊抗小鼠Ig G染色后,细胞内均呈现绿色荧光。上述结果表明,VP3基因能在HEK293AD和GEF中高效表达,重组VP3蛋白能与GPV抗血清发生特异性免疫反应。(4)rAd-VP3的免疫原性:用rAd-VP3免疫SPF级昆明小鼠血清中抗体效价可达1:264,小鼠血清能有效抑制GPV感染GEF引起的细胞病变;rAd-VP3免疫雏鹅14d后能产生较高水平的GPV抗体,免疫后28 d,血清抗体仍维持在较高水平。综上所述,本研究成功构建了表达GPV主要结构蛋白VP3的重组腺病毒rAd-VP3。rAd-VP3能感染HEK293AD和GEF细胞,并在其中高效表达VP3蛋白;rAd-VP3具有良好的免疫原性,可诱导小鼠和雏鹅产生中和抗体。本研究结果为研究安全、高效的GPV重组疫苗奠定良好的基础。