功能核酸的筛选及在分析检测中的应用

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功能核酸是指通过指数富集式配体系统进化(SELEX)技术从随机寡聚核苷酸库中筛选出的能与靶标物(小分子、蛋白质,甚至整个细胞等)高特异性、高亲和力结合的寡聚核苷酸,其识别靶标物的机制类似于抗原-抗体间的相互作用。但与抗体相比,功能核酸还具有可识别的靶标物范围广、制备合成简单、亲和力强、分子量小、稳定性好和设计灵活等优点。因此,近几年来功能核酸的研究在分析检测领域备受关注。目前,针对不同需求的功能核酸传感器都有相关报道,然而,大多数传感器所用的分析检测手段或步骤繁琐,或成本高昂,或灵敏度低,或抗干扰能力弱,尚需进一步完善和发展。在此背景下,本论文致力于改进和填补现有功能核酸传感器的不足和空白,设计和构建廉价、快速、灵敏的分析检测新方法和新技术,对传统的基于光学(表面增强拉曼散射光谱,紫外可见吸收光谱和荧光光谱)的检测方法做了进一步的探索和改进,论文所开展的工作如下:(1) L-miR122核酸适配体的筛选(第二章):miR122是肝脏中特有的一种miRNA,能够调节脂肪酸、胆固醇的代谢和肝脏的分化。研究发现,它与丙型肝炎病毒的发生和发展密切相关。本章通过体外SELEX技术,以L-miR122为模型靶标物,从随机寡聚核苷酸文库中筛选出一组L-miR122的适配体,并用软件对筛选的适配体进行一级结构同源性和二级结构相似性分析。该工作首次筛选出L构型的RNA适配体,为从分子水平研究基因功能和治疗疾病开拓出一种新的思路。(2)表面增强拉曼散射(SERS)传感器的构建(第三章):针对EIS适配体传感器在蛋白质检测中灵敏度不高的缺点,本章以凝血酶为靶标蛋白,发展了一种简单、快速、灵敏的检测凝血酶的方法。首先采用溶胶凝胶技术合成了以Au@Ag为核,Si02为壳,内部包裹有拉曼染料分子的表面增强拉曼探针,而后通过将拉曼染料分子和生物识别分子修饰到不同的壳层,避免了它们在修饰位点上的竞争。此方法具有以下的优点:a拉曼染料分子具有特异的光谱峰,可以避免生物复杂体系背景信号的干扰;b核壳结构的表面增强拉曼探针具有较低的非特异吸附;c稳定性好,灵敏度和选择性高。结果表明,该方法可以成功用于复杂样品血浆中凝血酶的检测。(3)比色传感器的构建(第四章):本章合成了过氧化物模拟酶Pt-DNA复合物,考察了其催化氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的可行性,并将催化反应用于双氧水和葡萄糖的免标记比色检测,实现了雪碧样品中葡萄糖的检测,检测过程不需要昂贵仪器,肉眼即可半定量。与传统免标记方法相比,本文所拟定的方法具有背景低、灵敏度高以及稳定性好等优点。此外,与天然的酶相比,所合成的Pt-DNA复合物模拟酶具有制备简单、热稳定性和化学稳定性好、可在苛刻条件下使用等优点。在经历变性复性后,对葡萄糖的检测限还可达0.1μM。(4)免标记型荧光传感器的构建(第五章)。铅离子是自然界中最具毒性的重金属离子之一,铅中毒会引发肠胃紊乱,肝、肾以及神经损伤。本文结合阳离子共轭聚合物聚噻吩和铅离子特异的DNAzyme,发展了一种免标记的铅离子荧光传感器。它是通过铅离子催化DNAzyme剪切底物链,导致双链DNA解离为单链DNA,而聚噻吩与单双链DNA作用后荧光强度不同,通过实时检测荧光即可达到检测铅离子的目的。实验结果表明该传感器对10nM-100μm范围内的铅离子有良好的响应,同时,该传感器对其它与铅离子共存的二价金属离子具有很好的抗干扰性。(5)标记型荧光传感器的构建(第六章和第七章)。利用水溶性氧化石墨烯和荧光探针分子FAM-ssDNA,建立了一种高灵敏、高选择的检测cTBA、凝血酶、Ag+、Hg2+和半胱氨酸的生物传感器。在所设计的体系中,首次发现了Ag+对FAM-ssDNA的荧光增敏效应。当体系中靶标物不存在时,探针呈自由卷曲状态,通过π-π堆积的作用吸附在氧化石墨烯表面,荧光被有效地猝灭。加入靶标物后,FAM-ssDNA构象发生改变,阻碍了氧化石墨烯与探针分子之间的相互作用,探针分子脱离氧化石墨烯表面,荧光信号得以恢复。根据荧光恢复的强度即可实现靶标物的高灵敏高选择性的检测。
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