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肥胖是世界上最常见的代谢性疾病之一,由于其与胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管疾病和某些癌症有关而被列为公共健康的一大杀手。FTO就是通过全基因组关联分析发现的一个与体重指数和肥胖有关的肥胖候选基因。本实验通过克隆猪FTO基因启动子序列和全长CDS序列,利用双荧光素酶基因检测报告系统和转录因子结合位点突变方法进行了启动子活性实验和转录因子结合实验,通过实时荧光定量PCR、甘油三酯及甘油含量的测定、mito Tracker7514染色、流式细胞技术等对FTO的功能进行了初步研究,得到如下结果：1、根据NCBI上公布的猪FTO5’侧翼区序列设计引物,克隆得到了2160bp的序列,经Genomatix网站预测与其结合的转录因子位点,在NIH/3T3细胞系里用双荧光素酶报告基因系统检测转录因子PPARy、CEBPα、CREB2、ChREBP、KLF6和KLF15对启动子活性的影响,以转染pcDNA3.1质粒为对照,结果发现转染KLF6后启动子活性有显著上调,转染KLF15后启动子活性有显著的下调。2、在HEK293A细胞中,超表达KLF6和KLF15后,实时荧光定量PCR检测FTO基因的mRNA水平变化,结果表明转染KLF6会显著上调HEK293A细胞中FTO mRNA的水平,而转染KLF15可以显著下调FTO mRNA的水平。3、为了进一步确定KLF6和KLF15是否直接与猪FTO启动子结合,对猪FTO启动子上所预测到的KLF6和KLF15结合位点进行定点突变,并在NIH/3T3细胞系里面与KLF6和KLF15进行共转染,测定启动子的双荧光素酶活性,结果发现与野生型相比,突变型的启动子活性基本恢复到对照的水平。由此推测KLF6和KLF15可能是通过该突变位点序列与猪FTO启动子结合,从而调节猪FTO启动子活性。4、甘油三酯测定分析FTO对脂肪沉积的作用,结果发现FTO可显著增加细胞内甘油三酯的含量。利用实时荧光定量PCR检测了与脂肪酸合成、氧化相关基因mRNA的表达水平,发现FTO可以显著上调脂肪酸合成相关基因的表达量,对脂肪酸氧化相关基因有一定的下调作用。测定细胞内的甘油含量,发现FTO可以显著下调HepG2细胞内甘油含量。测定脂滴相关蛋白基因,发现FTO可以显著上调PLIN、ADRP基因的表达。5、在HEK293A细胞中超表达FTO,定量PCR检测ntDNA和mitoTracker7514染色后经流式细胞仪检测荧光强度,发现FTO可以极显著下调细胞内线粒体的数量。进一步检测与线粒体融合、分裂和生成相关的基因,结果表明FTO导致细胞线粒体数量下降的原因是促进线粒体融合、抑制线粒体分裂。