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维生素D3羟化酶（Vdh）是一种来自于自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophicais的细胞色素P450单加氧酶,其可催化维生素D3（VD3）羟基化,生成VD3的活性形式——25羟基维生素D3[25（OH）VD3]和1α,25-二羟基维生素D3[1α,25（OH）2VD3]。利用Vdh制备活性VD3具有绿色环保,立体选择性好等优点,相比于化学合成法具有更好的商业前景。Vdh需要与氧化还原伴侣结合共同催化羟化反应,但是由于长久以来对于Vdh的天然氧化还原伴侣一直缺乏研究,并且商业化的电子传递链不能很好的与Vdh耦合,难以满足人们的催化需求,同时有关Vdh的催化底物特征报道十分有限,有待进一步研究。因此本论文通过同源建模,分子对接,虚拟丙氨酸扫描和分子动力学的计算方法,对Vdh电子传递链进行研究并对Vdh的底物进行虚拟筛选和验证。研究的主要内容如下:（1）基于分子动力学模拟对VD3羟化酶关键位点的理性改造及其对VD3转化效率的影响研究。本研究利用同源建模的方法得到了菠菜铁氧还蛋白（Fdx）的结构,通过分子对接得到Vdh-Fdx的复合结构。随后又利用丙氨酸扫描技术找到Vdh与Fdx结合界面的作用残基,对关键残基（Arg55、Arg99、Lys100、Gly103、Arg104、Thr107、Val108、Arg109、Phe339、Phe340、Phe346、Gln351、Arg354和Arg358）进行虚拟饱和突变。根据突变能选择了突变体Vdh T107K,Vdh V108W为最佳突变体（Vdh T107K:-3.31 kcal/mol,Vdh V108W:-2.27 kcal/mol）。利用定点突变技术,获得了Vdh T107K和Vdh V108W基因,并将其和野生型Vdh分别与p MD19-T或p ET-28a连接。之后在体外诱导表达得到目的蛋白。使用表达得到的野生型Vdh和Vdh突变蛋白分别对VD3进行催化。催化产物经高效液相色谱分析（HPLC）。结果表明突变蛋白的转化效率高于野生型Vdh,突变蛋白Vdh T107K对VD3的平均转化率为28.80%,Vdh V108W对VD3的平均转化率为25.72%,而野生型Vdh对VD3的平均转化率为9.12%。最后通过计算机模拟技术探究了影响突变蛋白VD3转化效率的原因。（2）连接肽的灵活性对VD3羟化酶与细胞色素P450还原酶融合蛋白转化效率的影响。通过PCR扩增的方法在Vdh和细胞色素P450还原酶（CPR）之间加入不同灵活性的连接肽构建融合蛋白Vdh-G-CPR（刚性连接肽）和Vdh-P-CPR（柔性连接肽）的重组克隆质粒。通过体外诱导获得目的蛋白。最后通过100ns的分子动力学模拟了刚性连接肽和柔性连接肽。我们发现柔性连接肽在模拟过程中发生了无规则卷曲,而刚性连接肽则一直保持线性结构。其中,融合蛋白Vdh-P-CPR对VD3的平均转化率最高,为61.31%,Vdh-G-CPR的对VD3平均转化率为30.38%。（3）基于分子动力学模拟对Vdh潜在底物谱的筛选。利用分子对接技术对ZINC化合物数据库进行筛选,结合打分,性质筛选及其广义伯恩表面积法（MM/GBSA）计算结合自由能,最终从中挑选出4个小分子进行了实验验证。从实验结果上来看,实验结果与筛选结果一致,4个小分子均能与Vdh发生反应,范德华力是Vdh与小分子结合的主要驱动力。总结小分子的性质得出数据库所选的化合物与VD3有着较高的相似性,均存在发生羟化的活性位点的可能。推测Vdh是生产类固醇类药物的潜在生物催化剂。