红树林放线菌中次级代谢产物的分离鉴定及核糖体工程的应用

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微生物次级代谢产物作为药物合成的重要前体物质之一,在新药研发方面做出了巨大的贡献,但是由于多药耐药菌株的不断增加,迫切需要具有更广泛生物活性的天然产物来合成新型药物。放线菌作为微生物生物活性代谢产物的主要来源具有重要的开发潜力,在医疗领域、农业等方面中得到了广泛的开发与应用。尤其是链霉菌,作为放线菌中的独特类群,有着复杂的次生代谢途径,是生物活性次级代谢产物的主要来源之一。红树林土壤由于其具有高温、高盐、缺氧的独特环境,其中放线菌种类十分丰富,是罕见的活性物质的潜在来源之一,有望从中分离出具有广泛生物活性且结构较为新颖的次级代谢产物。本论文通过对红树林土壤来源的放线菌进行生物活性筛选,得到一株对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均具有较强抑菌活性的菌株,经过16Sr RNA基因检测,在BLAST中与数据库比对显示为链霉菌属,将其命名为Streptomyces sp.155。用R5A液体培养基对该活性菌株进行大量发酵,用乙酸乙酯萃取发酵液,经旋蒸仪旋蒸、真空浓缩干燥后,再进行硅胶柱层析分离、高效液相色谱柱分离纯化,获得化合物1、2、3,其中化合物1具有较大的抑菌活性,采用高分辨质谱(HR-ESI-MS)、核磁共振波谱(NMR)对其结构进行鉴定,经过谱图分析、与文献对比发现该化合物是抗生素棘霉素(Echinomycin)的类似物。通过对菌株Streptomyces sp.155进行基因组测序,获得总长为8149490bp的基因组序列,GC含量为71.58%,其中有7238个编码基因,通过基因功能分类注释了7092个基因。通过antiSMASH 5.1.2对次级代谢产物基因簇分析,共有28个次级代谢产物基因簇,发现其中的两个基因簇与核糖体肽类化合物如echinomycin、streptobactin等生物合成基因簇具有94%的同源性,并且还有一些编码产物为聚酮类、萜烯类、细胞素、黑色素等化合物的生物合成基因簇,说明该菌株具有合成这类天然产物的潜力。核糖体工程是利用抗生素诱导核糖体或RNA聚合酶相关基因的突变,改变菌株的环境耐受性,从而影响其次级代谢产物的生物合成。利用核糖体工程对检测无抑菌活性的放线菌菌株进行抗生素突变实验,期望能够激活其中的沉默基因簇,获得新型的次级代谢产物。以链霉素、利福平、庆大霉素三种抗生素为筛选抗性,经过抗生素的最小抑制浓度(MIC)的初步确定,再扩大3-30倍MIC抗生素浓度进行突变菌株筛选,最终获得5株由利福平抗性突变获得的菌株,经过ISP4液体培养基发酵提取物高效液相色谱及抑菌活性检测,发现在5株突变菌中有2株菌有特异性产物出现,并且对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌ATCC 25922均有较强抑菌活性。
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