[研究背景]大肠埃希菌是引起医院内感染最常见的病原菌。碳青霉烯类药物具有抗菌谱广、杀菌活性大的特点,是对抗肠杆菌科多重耐药菌株最有效的抗菌药物。然而,随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用,碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem resistant Enterobacteriaceae,CRE)正在医院内悄悄泛滥。由于碳青霉烯类抗生素耐药的细菌同时也对β-内酰胺类药物以外的大部分常用抗生素耐药,该类病原菌感染给临床治疗带来了很大的挑战。据报道,感染CRE菌株的患者死亡率远远高于对照组和碳青霉烯类敏感组,CRE血流感染死亡率高达500%。世界各地及中国部分地区均有CRE局部流行、暴发的报道。产碳青霉烯酶、高产ESBLs和/或AmpC酶联合膜孔蛋白缺失是导致CRE的主要原因。耐药机制不同,临床用药也有所不同,比如新药头孢他啶/阿维巴坦的上市给革兰阴性细菌感染的治疗带了新的选择,遗憾的是它对A型类(ESBLs和KPC)和C类p-内酰胺酶具有良好活性,但对于B类碳青霉烯酶酶没有效果(NDM、IMP)。根据2012年一项全国范围的调查,KPC酶是主要的碳青霉烯酶。但2016年中国一项大规模调查表明耐药机制已经发生变化,各个地区、各个肠杆菌科种属间,也有所不同。北京、上海、四川地区碳青霉烯类耐药大肠埃希菌主要产KPC-2酶,湖南省耐药菌主要产IMP-4酶,另外一些地区则以产NDM酶为主。NDM金属酶在碳青霉烯酶中正占据越来越大的比例。我院新生儿病房于2012年-2013年爆发了产NDM-1肺炎克雷伯菌引起的医院感染暴发,但产NDM的大肠埃希菌的流行情况尚不清楚。新德里1型金属β-内酰胺酶(NDM-1)是一种新型碳青霉烯酶,耐药表型和传播机制不同于其他碳青霉烯酶,皆次于2009年在印度新德里患者所感染肠杆菌科细菌中发现,此后迅速播散至全球,尽管目前产NDM酶导致的CRE比例较低,但分布范围较广,加拿大、澳大利亚、韩国、日本、意大利等国均有报道,亚洲是产NDM酶菌株流行的主要区域。NDM酶正在快速地进化,已有NDM-1～NDM-17共17个NDM亚型报道。产NDM肠杆菌科细菌的来源,尚有争议。有的学者认为我国与印度毗邻,印度是NDM的主要输出国,印度旅游史/医疗史导致了 NDM的播散,但也有的学者认为我国的NDM菌株是一个独立进化的过程。目前,山东省缺乏对碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌(Carbapenem resistant Escheichia oli,CREC)中产NDM株的流行情况与传播机制调查,本文旨在研究CREC的表型筛选、分子流行病学、耐药机制、耐药性传播,以协助临床合理选择抗生素、防控耐药菌的传播,及阻断耐药性的播散。尽管Montanari等学者认为细菌为了获得耐药基因,有丢弃一些毒力基因的适应性代价(fitness cost),但已经有高毒力、高耐药性肺炎克雷伯菌的报道。碳青霉烯类耐药的高产毒肺炎克雷伯菌(HvKP)引起了全球恐慌,荚膜多糖是这类细菌主要毒力因子,可以对抗嗜中性粒细胞的吞噬,免于宿主的免疫杀伤而致病,从而引起全身感染的播散和脓肿的形成。碳青霉烯类耐药的肠外感染大肠埃希菌的毒力情况尚未见报道。高度耐药和高致病力将成为公共健康的潜在危害,有必要对耐药菌中的高致病株进行筛查。初始、正确的抗生素使用对于重症患者的预后有很大的影响,传统的微生物学检验比较慢,药物敏感性结果通常滞后于鉴定结果1-2天,这往往造成临床患者错失最佳治疗时机。质谱技术是近年来新兴的微生物鉴定技术,能够在半小时内得到准确的鉴定结果,但应用于微生物药物敏感性方面还处于萌芽阶段。将质谱技术与菌株耐药表型筛选结合起来是一种新的尝试和趋势,能够更早期的指导临床合理使用抗生素。本研究收集了 2015年山东省立医院临床分离的CREC 23株,对菌株的表型和耐药机制进行了系统性研究,重点描述了产NDM菌株的分子流行病学和耐药机制。山东省立医院属于山东省最大规模的教学医院,患者来自全省各地,具有山东区域代表性特色,也完善了我国北方地区CREC的分子流行病学资料。研究共分为五个部分:第一部分碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的筛选及药敏试验;第二部分碳青霉烯类耐药大肠埃希菌同源性分析;第三部分产NDM菌株分子特点与耐药传播机制研究;第四部分大肠埃希菌毒力因子研究;第五部分飞行时间质谱技术在检测产NDM菌株中的应用。[目的]1.了解CREC药物敏感性,进行菌株的表型筛选及同源性分析。2.研究我院产NDM菌株在CREC中流行情况及耐药基因的可传播性。3.研究大肠埃希菌毒力因子与系统性进化分型、耐药基因的相关性。4.建立使用飞行时间质谱技术快速检测产碳青霉烯酶菌株的方法。[材料与方法]1.菌株收集收集山东省立医院2015年1月至12月,临床分离的CREC菌株(患者来自全省各个地区),保存有菌种的共23株。另外,收集碳青霉烯类敏感的大肠埃希菌20株,作为质谱检测产碳青霉烯酶菌株的阴性对照。采用梅里埃VITEK Compact和梅里埃基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对菌种进行确认。2.表型筛选与药敏试验对CREC菌株进行表型筛选实验,包括改良Hodge试验(MHT)、ETP-EDTA双纸片协同试验、ETP-EDTA复合纸片试验、改良碳青霉烯酶失活试验(mCIM)。对确认为CREC的菌株进行微量肉汤稀释法和E-test法药物敏感性实验,敏感性判断标准为(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSIM100-S26)。3.同源性分析对CREC菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)试验和多位点序列分析(MLST),分析菌株的同源性。PFGE:将菌体基因组DNA包埋于小胶块内,进行胶块内细胞裂解、XbaI酶切、脉冲场凝胶电泳,使用Bionumerics软件对电泳指纹图谱进行比对,分析菌株的同源性,研究菌株克隆传播的情况。MLST:煮沸法提取菌株基因组DNA,扩增七个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA),测序后将序列信息录入MLST网站(http://www.MLST.net/),获得相应的等位基因号码,再根据7个等位基因的组合,获得菌株ST型。采用eBURST软件对菌株进行聚类同源性分析,MEGA6软件对菌株的系统性进化进行分析。4.耐药基因检测对23株CREC菌株进行了耐药基基因PCR扩增和测序,了解NDM及其他耐药基因在CREC中的流行情况,包括碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNMC、blasME、blaIMI、blaGGES、blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaSIM、blaGIM、blaNDM、blaOXA),AmpC 酶基因(blaACC,blaACT,blaBIL,blaCMI,blaDHA,blaFOX,blaLAT,blaMIR 和blaMOX),超广谱 β-内酰酸胺酶基因(blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M),磷霉素耐药基因(fosA、fosC、fosA3),喹诺酮类耐药基因扩增(qnrA、qnrB、qnC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6’)-Ib-cr),16S rRNA甲基化基因(armA,npmA,rmtA,rmtB,rmtCandrmtD),粘菌素耐药基因(MCR-1)。对于碳青霉烯类耐药基因扩增阴性菌株,提取细菌外膜总蛋白,进行SDS-PFGE蛋白电泳,分析膜孔蛋白缺失情况。5.传播机制检测对20株产NDM的CREC菌株进行了质粒接合转移实验和电转化试验检验耐药基因是否可以通过质粒在菌株间水平传播,并对接合子进行了肉汤稀释法和E-test法药物敏感性试验来分析质粒的耐药性。对临床菌株和获得的结合子进行了 S1酶切PFGE,分析临床菌株、接合子携带质粒数量、大小,对接合子S1酶切PFGE条带进行切胶、PCR,确认是否携带碳青霉烯耐药基因。提取接合子基因组DNA,通过PCR-basedreplicon typing(PBRT)的方法对所携带质粒进行分型。无抗生素选择压力下反复传代,来检验耐药质粒在菌株中的稳定性。提取接合子质粒进行二代测序,分析碳青霉烯耐药基因周围环境,以及各菌株耐药质粒之间的进化关系。6.系统性进化分群与毒力因子检测按照Clermont建立的方法,通过PCR扩增(ChuA、YjaA、TspE4C2)将CREC菌株进行系统性进化分群。同时进行多重PCR扩增常见肠外感染大肠埃希菌毒力因子(PAI、papA、fimH、kpsMTⅢ、papEF等共31个基因),采用SPSS软件,对菌株MLST分型、ESBLs基因型、NDM型与致病因子的相关性进行Fisher’s精确检验。7.质谱检测采用CHCA作为小分子量参照物,对梅里埃微生物鉴定质谱仪VITEK MS进行定标。厄他培南作为底物,与临床菌株作用后检测厄他培南质谱峰图改变,建立质谱快速检测碳青霉烯酶产酶菌株的方法学,并对其特异性和敏感性进行评价。[结果]1.2015年全院共分离出大肠埃希菌1575株,其中碳青霉烯类耐药大肠埃希菌38株(约占2.4%),分别来自尿液47.2%(20/38)、痰18.9%(7/38)、创面分泌物 11.3%(4/38)、腹腔标本 15.79%(6/38)、血液 3.8%(1/38)。CREC主要来自泌尿外科26.3%(10/38),15.8%(6/38)来自儿科,15.8%(6/38)来自ICU。保存有菌株的有23株(其中一株来自同一患者的不同感染部位)。22位患者中有7位明确使用过碳青霉烯类抗菌药物,除了一位患者以外都有过侵入性操作(放置引流管、气管切开、静脉置管、留置导尿管等)。2.所有菌株均对头孢菌素类、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁、氟喹诺酮类全部耐药,并且耐药水平较高,MIC值均≥128 μg/ml;23株菌株中仅一株对氨曲南敏感。但所有菌株对替加环素、多粘菌素B均为敏感。对阿米卡星的敏感性也较高,23株中仅4株耐药,庆大霉素耐药率为47.82%(11/23)。值得关注的是,磷霉素耐药率为30.43%(7/23)。3.23株菌株中共有20株NDM基因阳性,其中NDM-5阳性菌株共12株,NDM-1阳性菌株共6株,NDM-7和NDM-3阳性菌株各1株。2、18、25号标本未扩增出碳青霉烯类耐药基因,提取这3株菌株外膜总蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳,与标准菌株ATCC 25922外膜总蛋白蛋白电泳条带比较,2号、18号缺失两条带,25号缺失一条带,这三株菌的耐药机制为膜孔蛋白缺失联合产ESBLs和AmpC。23株CREC菌株中,22株携带ESBLs基因,7株AmpC酶基因阳性。CTX-M和TEM为最常见的ESBLs基因,对扩增的片段测序以确定具体CTX-M基因亚型和TEM基因亚型。19株TEM阳性菌株全部为TEM-1型。最常见的CTX-M亚型为CTX-M-14,共13株;其次为CTX-M-15,共检出6株,CTX-M-55共检出6株。其中16株携带两种以上ESBLs基因,6株携带两种CTX-M亚型基因。4株阿米卡星耐药菌株均由16S rRNA甲基化引起。23株临床菌株全部对喹诺酮类药物耐药,18株喹诺酮耐药基因阳性,9株为qnrB基因,8株为qnrS基因,7株为qnrS和aac(6’)-Ib-c同时阳性,其余5株可能为其他机制导致的喹诺酮类耐药。7株磷霉素耐药菌株全部由fosA3基因引起。4.按Tenover标准,采用相似度80%为cut-off值,23株CRE可以分为11个亚群,其中一个亚群中3株菌相似度大于90%,提示存在克隆菌株流行。同一亚群中菌株间的PFGE指纹图谱及所携带的耐药基因又存在差别,比如9号菌株与8号、12号菌株指纹图谱相似度大于85%,均为ST410,但8号和12号携带NDM-1,9号携带NDM-5,并且9号耐药质粒同时携带有fosA3基因,证明菌株在克隆传播过程中获得了不同的耐药质粒。后续试验中有必要对接合了 J9和J8、J12的质粒序列做比对,研究耐药质粒进化关系。15号菌株和23号菌株相似度>90%,同为ST167型,15号菌株携带CTX-M基因而23号菌株为阴性,接合子J15中携带NDM的质粒约120 kb,而接合子J23携带NDM的质粒约50 kb。同样的情况还有4号和11号菌株。这些都证明菌株在克隆传播的过程中发生了耐药基因的整合或丢失及菌株的进化。MLST与PFGE同源性分析结果一致,但区分菌株近期克隆传播分辨力不如PFGE。23株大肠埃希菌共检出7种ST型。其中,ST167型 11 株,ST617 型 3 株、ST405 型 3 株、ST410 型 3 株,ST361 型、ST744 型、ST5229型各有1株。分析PFGE指纹图谱,ST167可以分为4种谱型,可能为不同来源或不同时期的流行菌株,后面试验中系统进化分群不同也证实了这点。eBRUST软件对7种ST型进行分析发现,ST617和ST167只相差一个管家基因为SLV,具有较近的亲缘关系,其余菌株均无近缘关系。使用MEGA6软件对ST型的进化关系进行分析,我院7种ST型为三个不同起源,其中CC167(ST167,ST617,ST744,ST361)为同一起源,CC410(ST410,ST5229)为同一起源,ST405不同于其他ST型。5.23株临床分离的CREC中含有1-6个质粒不等,15株携带50 kb大小左右的质粒,11株同时携带80 kb、50 kb左右两个质粒(其中7株为ST167,2株为ST410,1株为ST5229,1株为ST405)。质粒接合转移试验共获得携带碳青霉烯耐药基因质粒接合子17株。产碳青霉烯酶的菌株中3株菌不能通过质粒接合转移试验获得对碳青霉烯类耐药的接合子,或者通过电转化试验获得转化子。对本实验中接合子对喹诺酮类全部为敏感,证明喹诺酮类耐药基因与NDM耐药基因不在同一个质粒上。接合子进行S1酶切PFGE发现11株接合子携带50 kb左右大小的耐药质粒,其中8个接合子仅携带50 kb质粒,3株接合子携带50 kb和80 kb两个质粒。另外4株接合子获得的质粒为70-80 kb左右,2株菌的耐药质粒为120-140 kb。质粒分型发现,14株接合子携带质粒为IncX3型质粒,1株为IncFⅡ型,2株为IncFⅡr型。在一次结合试验中,4号接合子获得了4个质粒,说明耐药质粒接合转移效率非常高,有文献报道,携带有NDM基因的质粒可能同时携带T4SS分泌系统,能够能够协助其他耐药质粒进入受体菌。去除抗生素筛选压力连续传代10次后,全部菌株仍存在对厄他培南的抗性,证明耐药质粒能够在菌株中稳定存在。6.23株临床菌株没有检出高致病力B2群,但3株属于致病力较强的D群(3株均为ST405型),16株属于B1群(7株为ST167型,3株为ST410型,2株为ST617型,ST361、ST5229、ST744各有一株),4株属于A群(3株为ST167型,1株为ST617型)。A群和B1群ST167菌株的PFGE指纹图谱有所不同,可能为不同来源菌株。所有菌株均未扩增出sfa/focD、sfaS、focG、afa/draBC、gafD、nfaE、fimH、hlyA、cnf1、cdtB、fyuA、iut、rfc、ibeA、cvaC、traT、papAH、pap EF基因。粘多糖合成相关基因cps(kpsMT ⅢkpsMT Ⅱ/K5)阳性菌株共10株。P菌毛papG基因阳性菌株共20株,papG Ⅱ型阳性19株,papG Ⅲ型阳性11株。P菌毛papC基因阳性菌株共3株,其中2株papG和papC同时阳性。3株致病相关岛(PAI)阳性。9株M血清型菌毛(bmaE)阳性。7株铁获得通路(iroN)阳性。采用Fisher’s精确检验,比较ESBLs基因型和毒力因子基因相关性发现,产CTX-M-15菌株中pap Ⅱ基因阳性率低于产CTX-M-55菌株。产NDM-1菌株比产NDM-5菌株中pap G Ⅲ携带率高。ST617与ST405比ST167携带papGⅢ的比例高,有更强的粘附、定植的能力。7.厄他培南作为底物,采用飞行时间质谱技术检测NDM型碳青霉烯酶产酶株CREC特异性和敏感性均为100%。[结论]1.我院CREC发生率约为2.4%,与全国CREC检出率基本一致。泌尿外科、儿科、ICU是CREC流行主要科室;尿液、腹腔标本(胆汁、腹水)、痰是耐药菌的主要来源。侵入性操作、使用过头孢菌素或碳青霉烯类药物是耐药菌发生的高危险因素。CREC菌株通常是多重耐药菌,但对替加环素、多粘菌素B全部敏感,阿米卡星也有较好的敏感性。本实验筛选出一株菌株磷霉素耐药基因与NDM基因在同一个可传播质粒上。磷霉素作为CREC选择性治疗药物时要慎重,这类泛耐药菌株的传播将给临床治疗带来更大的挑战,应加强筛查和控制。2.NDM是我院引起CREC的主要因素,最常见的NDM亚型为NDM-5,约占52%(12/23),其次为NDM-1(6/23),这区别于国内其他地区以NDM-1为主的流行情况。ST167是我院CREC主要流行株,也是NDM-5的主要携带者。另外检出ST617、ST405、ST410等6种ST型。除了 NDM基因,CREC通常还携带喹诺酮、氨基糖苷等多种耐药基因。TEM-1和CTX-M-14是我院最主要ESBLs基因型,其次为CTX-M-15。大部分菌株同时携带两种以上ESBLs基因,对β-内酰胺类药物有较强的水解能力。3.我院既存在耐药菌株的克隆传播,又存在耐药质粒的水平传播,质粒水平传播过程中存在耐药基因的整合。IncX3型质粒是携带NDM基因的主要载体,也有少量IncFⅡ、IncFⅡr型质粒的检出。大部分质粒为50kb大小,其余70-130 kb大小不等。具有可兼容其他质粒的特点,容易在菌株间水平传播,且该质粒能够在临床菌株中稳定存在。以往认为,CREC较少引起暴发、流行,关注度比较低。但本实验证实,IncX3质粒容易传播,可能造成CREC发生率升高,甚至流行,应加强携带这类质粒菌株的筛查和监控。4.我院CREC未检出高致病性B2群菌株,但检出相对高毒力的D群菌株3株,本研究第一次报道了我国携带NDM的D群大肠埃希菌ST405菌株。粘多糖、P菌毛、M菌毛、铁转运蛋白在大肠埃希菌粘附、定植和致病力增强中起了重要作用。5.厄他培南作为底物,采用飞行时间质谱技术检测产碳青霉烯酶菌株具有较好的敏感性和特异性,在临床开展应用具有良好的前景。