在被子植物的生活史中,孢子体世代（二倍体世代）与配子体世代（单倍体世代）交替出现,这种现象被称为世代交替。孢子体生长发育形成配子体。雌雄配子体发育成熟后,通过双受精作用,来自花粉中的两个精细胞分别与卵细胞和中央细胞结合,形成受精卵（合子）和初生胚乳细胞,进入孢子体世代。合子经过一系列的分裂与分化最终形成成熟胚胎,而初生胚乳细胞经过一系列分裂形成合胞体胚乳,经细胞化产生胚乳,在拟南芥中,当胚胎发育至鱼雷期时胚乳降解。在胚胎和胚乳的发育过程中,伴随着一系列DNA复制过程,RFC复合体作为DNA复制的关键因子在胚胎发育过程中发挥功能。RFC复合体由不冗余的5个亚基RFC1/2/3/4/5组成。在人和酵母中,研究表明RFC复合体参与DNA复制、DNA修复与细胞周期调控等重要事件。由于RFC复合体在生命活动中的重要性,研究者们进行了大量的研究。目前在人和酵母中,RFC（Replication Complex C,复制因子C）复合体的结构与功能已经被研究得比较透彻,而在高等植物中,对RFC复合体基因功能研究较少。本实验室研究发现在拟南芥中At RFC1突变使减数分裂过程中DNA同源重组修复受阻,导致雌雄配子体发育异常;At RFC4缺失使DNA复制受阻,最终导致胚胎和胚乳发育停滞。另有研究表明,At RFC3参与植物茉莉酸途径的应答,该基因突变使植物抗病性增强,该结果表明在拟南芥中RFC复合体各亚基除参与RFC复合体的形成外可能各自还有其独特的生物学功能。PCNA（Proliferation Cell Nuclear Antigen,增殖细胞核抗原）是真核生物中的DNA滑动夹,在DNA复制过程中起着非常重要的作用。在人和酵母中,研究显示PCNA参与了DNA的复制与修复,并且介导了细胞周期蛋白Cdt1的降解,防止DNA发生二次复制。在高等植物中,对于PCNA蛋白功能的研究未见报道。在拟南芥中,PCNA蛋白包含PCNA1和PCNA2两个蛋白,由于缺少对应的突变体,目前关于拟南芥PCNA1和PCNA2的生物学功能、二者的差异、互作关系及组成等均未见报道。因为RFC3和PCNA滑动夹在DNA复制过程中的重要性,且关于它们在高等植物中生物学功能的报道较少,因此本实验室对拟南芥RFC3基因、PCNA1及PCNA2基因展开了研究。本研究以拟南芥rfc3突变体和RFC3基因过表达植株为材料,利用启动子序列分析、胚珠透明、花粉染色等生物信息学、遗传学、细胞生物学、分子生物学方法,研究了rfc3突变体和RFC3过表达植株的表型,并构建了PCNA1和PCNA2的基因编辑载体,通过浸花转基因获得了转基因植株。获得的主要结果如下:1.采用三引物法对rfc3突变体基因型组成进行鉴定,未发现纯合的rfc3突变体植株,仅获得杂合体植株,进一步对rfc3突变体的角果表型进行观察并统计败育率,发现杂合突变体角果中白色败育胚珠的比例为24.92%,该比例符合隐性突变纯合致死的比例,表明RFC3纯合突变可能导致胚胎败育。为了明确败育的原因,对拟南芥rfc3杂合突变体的的胚珠进行透明观察,观察发现,胚乳游离核数目的减少开始于伸长合子时期,进一步研究发现其败育胚珠中胚胎最终停滞在2/4-细胞时期,并且胚乳游离核数目显著减少;统计了1-细胞时期拟南芥野生型与rfc3突变体中异常胚珠的胚乳游离核的数目,此时野生型胚珠内平均含有17.45个胚乳游离核,而纯合突变胚珠内平均仅含有5.22个胚乳游离核。以上结果表明,RFC3基因纯合突变同时影响了胚胎与胚乳的发育,最终导致了种子败育。2.获得了4个35S::Venus-RFC3转基因株系,并用于后续的研究。对拟南芥转基因植株进行观察,发现转基因植株中胚珠部分败育。野生型的胚珠败育率为1.82%。在RFC3OE3-1的胚珠败育率为13.79%,RFC3OE4-1的胚珠败育率为9.79%,RFC3OE6-2株系的胚珠败育率为6.56%,RFC3OE9-1的胚珠败育率为1.99%。暗示转入35S::Venus-RFC3质粒可能是引起这些植株中胚珠败育的原因。对RFC3过表达植株花粉进行染色,发现各个株系中花粉有不同程度的败育。采用碘-碘化钾对各个过表达株系花粉进行染色,并统计花粉的败育率。野生型花粉的败育率为6.99%。转基因植株RFC3OE3-1花粉败育率为12.57%,RFC3OE4-1的败育率为14.69%,RFC3OE6-2的败育率为5.90%,RFC3OE9-1的败育率为6.14%。推测转入35S::Venus-RFC3质粒可能是引起这些植株中花粉败育的原因。对RFC3过表达植株中的可育胚珠进行观察,发现在过表达植株RFC3OE3-1和RFC3OE4-1两个株系中胚胎发育进程明显快于野生型,在RFC3OE6-2和RFC3OE9-1两个株系中,发育进程则与野生型相似。以上结果表明,转入35S::Venus-RFC3质粒可能是引起这些植株中胚胎发育进程加快的原因。3.对人类、线虫、酵母、拟南芥和水稻等18个物种中PCNA蛋白进行了序列比对和进化树分析,发现其在各个物种中PCNA蛋白质的氨基酸序列均比较保守。并且在一些植物中与拟南芥一样存在两种PCNA蛋白,而水稻中仅有一种,表明不同物种中PCNA蛋白的数目具有一定的差异。对拟南芥PCNA1和PCNA2的启动子进行分析,发现在拟南芥PCNA1启动子上含有E2F家族转录因子结合位点,PCNA1可能受到E2F家族转录因子的转录调节。同时,在PCNA1的启动子上找到了逆境响应元件,暗示PCNA1可能参与植物的逆境响应。在PCNA2启动子上含有在细胞周期M期表达的启动子元件,在PCNA1的启动子上未发现该元件,暗示PCNA2基因可能在细胞周期中发挥作用。4.构建了PCNA1-CR、PCNA2-CR和PCNA1/2-CR基因编辑载体,采用浸花转基因技术分别获得了5株PCNA1-CR转基因植株、9株PCNA2-CR转基因植株及6株PCNA1/2-CR转基因植株。对它们进行转基因背景鉴定并测序,但并未发现在靶位点上编辑的转基因植株,表明将需要进一步展开转基因研究。