论文部分内容阅读
本论文以核盘菌弱毒菌株Ep-1PN为材料,对核盘菌弱毒菌株Ep-1PN中的核盘菌衰退相关RNA病毒(SsDRV)的基因组序列进行了修正、构建了侵染性载体构建并对该载体进行了初步的验证。
实验室前期构建的一个双元载体p1301-SsDRV,利用农杆菌介导转化技术转化盾壳霉。获得了105个转化子,PCR验证了T-DNA已成功导入到盾壳霉菌株ZS-1中。对转化子的菌落形态、菌丝生长速度、孢子产量、寄生致腐菌核等生物学特性进行了研究,结果表明导入SsDRV-cDNA未引起盾壳霉ZS-1出现显著的异常表型。采用RT-PCR可以检测到目的SsDRV-cDNA的mRNA,但未能检出dsRNA。通过对已知的SsDRV基因组进行分析,推测其5’末端序列可能存在未知的RNA片段。
提取核盘菌弱毒菌株Ep-1PN的总RNA,采用SMART(Switching Mechanism At5’end of the RNA Transcript,SMART)技术克隆了SsDRV基因组的5’末端还存在82 nt的RNA片段。SsDRV基因组全长为5500个核苷酸序列(不包括polyA),只有一个开放式阅读框(174nt-5274nt)。SsDRV的5末端含有一个帽子结构。进一步分析发现,SsDRV的基因组在5‘端存在着变异,其3’端含有polyA结构。对5’-UTR和3’-UTR进行二级结构预测,5’-UTR形成发夹结构,有一个AU富含区,3’-UTR形成类似tRNA结构。
分段扩增SsDRV的cDNA,分别连入pUH18的构巢曲霉的trpC启动子下游和trpC终止子的上游,得到SsDRV的全长cDNA侵染性载体pTSVH。利用电穿孔转化核盘菌的原生质体,将线性化载体pTSVH导入核盘菌Ep-1PNA367的染色体中,获得了9个转化子。对转化子的生物学特性进行了分析,发现转化子生长缓慢且致病力减弱。通过PCR检测证实核盘菌菌株Ep-1PNA367中含有SsDRV的cDNA;RT-PCR检测表明SsDRV的cDNA的mRNA,但是采用纤维素CF-11法未检测到SsDRV的复制体形式dsRNA。