癌症是导致人类和动物死亡、引发重大公共卫生问题的第二大原因。近年来,随着宠物业的兴起,犬的平均寿命增加,犬肿瘤发病率也随之上升。目前犬恶性肿瘤在兽医临床中的治疗方法主要以手术切除为主,同时给予化疗、放疗等辅助治疗。然而,这些方法通常都会对病犬产生短期或长期的副作用,给病犬生命带来严重威胁。因此,继续寻找更加安全、有效、无毒副作用、可耐受的抗癌疗法和组合方案是研究人员面临的主要挑战之一。天然产物因其可观的抗肿瘤效果、丰富的来源、较低的细胞毒性,逐渐成为新型抗癌药物的研发方向。在各种天然产物中,植物多糖是预防和治疗癌症值得开发的效果优良的产品。前期研究证明松花粉多糖（Pinus massoniana pollen polysaccharides,PPPS）对多种肿瘤细胞生长均有一定的抑制作用,但松花粉多糖的作用靶点及其抗肿瘤作用机制尚不清楚。因此,本研究首先从体内、体外两个方面评估松花粉多糖的抗肿瘤效果,并通过转录组分析筛选并验证松花粉多糖发挥抗肿瘤作用的关键信号通路,进一步探究松花粉多糖发挥抗肿瘤作用的关键靶点,并揭示关键靶点蛋白在肿瘤发生发展的作用。本研究旨在为松花粉多糖在肿瘤预防和治疗中的作用以及抗肿瘤药物的靶向治疗提供理论依据。本研究主要分为以下四部分内容:1、松花粉多糖体外抗肿瘤效果评价为探究松花粉多糖是否具有良好的抗肿瘤效果,首先选取四种常见的肿瘤细胞系,通过细胞毒性试验评估PPPS对肿瘤细胞增殖的影响,发现PPPS在安全浓度内对结肠癌HCT-116细胞抑制作用效果最好;其次,选取四种常见多糖,对比不同多糖的抗结肠癌效果,发现PPPS的抗结肠癌效果仅次于香菇多糖。因此,选用两种常见的结肠癌细胞系HCT-116和HT-29细胞,发现PPPS可显著抑制HCT-116和HT-29细胞生长,且呈时间依赖性;细胞克隆形成试验结果表明,PPPS可以显著抑制HCT-116细胞的增殖。进一步通过形态学分析评估PPPS的抗结肠癌作用,Hoechest 33342结果显示PPPS处理造成HCT-116和HT-29细胞核浓缩和碎裂;通过透射电镜观察HCT-116亚细胞结构发现,400 μg/mL PPPS造成细胞质肿胀,细胞核染色质凝集并发生边缘化,线粒体嵴结构破坏并出现空泡化。随后,我们通过流式细胞仪分析PPPS对结肠癌细胞细胞凋亡及细胞周期的影响,结果显示,PPPS可以显著促进结肠癌细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G0/G1期。此外,免疫印迹结果显示,400 μg/mL PPPS可以显著增加Cleaved Caspase-3,-6,-7和-PARP蛋白的表达水平。Transwell细胞迁移试验结果表明PPPS可以显著抑制HCT-116和HT-29细胞迁移,并下调细胞上清和细胞裂解物中MMP-9蛋白表达水平,荧光定量结果显示,PPPS抑制HCT-116细胞发生EMT。因此,PPPS在体外表现出良好的抗结肠癌作用。2、松花粉多糖在结肠癌裸鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用本试验首先选取20只4周龄的裸鼠将其饲养在独立通风笼具中,随机分为PPPS治疗组（PPPS-Ther组）、PPPS预防组（PPPS-Prev组）、阳性药物组（5-FU组）和阴性对照组（Control组）,通过皮下接种HCT-116细胞建立结肠癌异种移植瘤模型。前三周对PPPS-Prev组小鼠腹腔注射400 mg/kg PPPS,每周两次。第四周开始对PPPS-Ther组小鼠腹腔注射400 mg/kg PPPS;对5-FU组小鼠腹腔注射50 mg/kg 5-FU,每周两次。期间记录裸鼠体重和肿瘤大小,6周后将所有小鼠安乐死,收集裸鼠血清、剥离肿瘤组织。小鼠生长曲线显示,PPPS-Ther组小鼠的体重明显高于其他三组,通过检测血清中LDH、AST和ALT水平证实,PPPS对小鼠没有肝肾毒性;肿瘤生长曲线显示,与空白对照组相比,PPPS-Ther组、PPPS-Prev组和5-FU组均能显著抑制肿瘤的生长,且PPPS治疗效果优于5-FU组。HE染色结果显示,与空白组相比,其他三组核分裂相减少且纤维组织较少;随后,我们通过免疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达量,结果显示,与Control组相比,PPPS-Ther组和PPPS-Prev组阳性信号减少但差异不显著。TUNEL组织切片免疫荧光结果显示PPPS-Ther组和5-FU组中的肿瘤组织发生明显凋亡;免疫印迹结果显示与空白对照组相比,PPPS-Ther组的Cleaved Caspase-3,-6,-7,-9和-PARP的表达水平显著增加。研究结果表明,400 mg/kg PPPS在体内可以显著抑制小鼠肿瘤的生长且对小鼠没有肝肾毒性。3、松花粉多糖抑制结肠癌细胞生长的转录组学分析及结果验证为进一步探究PPPS的抗结肠癌机制,我们通过转录组学分析探究400 μg/mL PPPS处理HCT-116细胞24 h基因的表达差异。在log2FC大于1且P值小于0.01的条件下共富集到20个上调基因和49个下调基因,KEGG富集结果显示,DEGs显著富集在TGF-β信号通路。为进一步探究TGF-β信号通路在肿瘤发生发展中的作用,我们首先检测了犬乳腺肿瘤组织中TGF-β1的表达情况,结果显示肿瘤组织中TGF-β1的表达显著高于癌旁组织;随后,我们选用一种TGF-β/Smad2信号通路激活剂TMAO,免疫印迹结果显示100 TMAO可以提高HCT-116细胞中TGF-β1、pSmad2及pSmad3蛋白的表达水平从而激活TGFβ/Smad2/3信号通路,增加MMP-9表达水平并促进结肠癌细胞伤口愈合从而促进结肠癌细胞迁移,但100 TMAO并不能诱导结肠癌细胞发生EMT。随后,通过免疫印迹和间接免疫荧光证明PPPS可以拮抗TMAO在结肠癌细胞中对TGF-β信号通路的激活作用;此外,通过检测结肠癌细胞中MMP-9的表达水平和伤口愈合能力,我们发现PPPS可以抵消100 TMAO对结肠癌细胞的促转移作用,且TMAO不能恢复PPPS对EMT相关转录因子mRNA表达水平的抑制作用。因此,PPPS通过TGFβ/Smad2/3信号通路抑制结肠癌细胞的转移。4、NR5A2通过激活TGFβ/Smad2/3信号通路从而促进结肠癌细胞转移为确定PPPS抑制结肠癌细胞转移的潜在靶标,我们首先通过荧光定量在3种常见的结肠癌细胞（HCT-116、HT-29和SW480细胞）中对DEGs中差异最显著的5个下调基因（分别为:NR5A2、LCA5L、EXO5、DCDC1和ZNF493）进行验证。结果显示,NR5A2在PPPS处理后显著下调。随后,我们通过间接免疫荧光和免疫印迹证明PPPS处理后结肠癌细胞中NR5A2蛋白水平也出现显著下调。为验证NR5A2在肿瘤发生发展中的作用,首先通过qRT-PCR检测结肠癌细胞（HCT-116、HT-29、SW480和Caco2细胞）和正常结肠上皮细胞（NCM460）中NR5A2的表达差异,结果显示,HCT-116和SW480细胞中NR5A2的表达水平均显著高于NCM460细胞;免疫荧光结果显示犬肿瘤组织中NR5A2的表达显著高于癌旁组织。因此,为进一步验证NR5A2在PPPS抗结肠癌中的作用,干扰NR5A2的表达使其在mRNA和蛋白水平表达显著下降。结果显示,NR5A2表达降低后,SW480细胞中TGF-β1、p-Smad2及p-Smad3蛋白表达水平显著下降,MMP-9的蛋白表达水平随之下降;划痕试验和荧光定量结果表明,NR5A2表达降低后,结肠癌细胞迁移能力降低,说明NR5A2可以介导TGF-β/Smad2/3信号通路促进结肠癌细胞转移。综上所述,PPPS作为一种天然药用植物多糖,在体内和体外都有良好的抗结直肠肿瘤作用。通过转录组学分析及机制探究发现,PPPS通过TGF-β/Smad2/3信号通路抑制结肠癌细胞转移,NR5A2是松花粉多糖发挥抗结肠癌作用的关键靶标,干扰NR5A2表达可以降低TGF-β/Smad2/3信号通路关键蛋白的表达水平从而抑制结肠癌细胞迁移。此外,犬恶性肿瘤组织中TGF-β1和NR5A2蛋白表达显著高于癌旁组织。因此,我们研究表明,PPPS可以作为肿瘤治疗或化学预防候选药物,TGF-β1和NR5A2有潜力成为犬恶性肿瘤治疗新的靶点,为新的药物的开发提供理论依据。