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实验目的:腺样囊性癌(Adenoid Cystic Carcinoma,ACC)是唾液腺的一种恶性肿瘤,在涎腺中较常见,侵袭腭腺较多。目前腺样囊性癌的主要临床治疗仍然是以手术结合放疗为主,由于其生物学行为较为惰性,腺样囊性癌对常规化学疗法不敏感,又因其特殊的解剖结构特点,导致其对放射疗法也不敏感。因此,腺样囊性癌的长期预后效果较差,局部复发和远处转移率较高,治疗效果不能令人满意。因此寻求特异性干预靶点对于针对性提高腺样囊性癌的治疗方案具有重要意义。硼替佐米(Bortezomib,BZ)是第一个获得美国FDA批准用于临床试验的小分子蛋白酶体抑制剂,是一种高度选择性的蛋白酶体抑制剂,它联合美法仑和泼尼松用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤已经是很成熟的临床治疗方法,在其他细胞系中均有文献证实其促凋亡作用如:乳腺癌MCF-7细胞、胃癌SGC7901细胞、胃癌MKN45细胞、子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞、卵巢癌SKOV-3/DDP细胞。但其在腺样囊性癌细胞中未见报道。本实验通过观察硼替佐米对腺样囊性癌细胞的增殖、凋亡及自噬的影响,旨在探究针对腺样囊性癌的新的分子靶向药物,以期为硼替佐米在腺样囊性癌中的临床治疗提供一定的实验参考。实验方法:在这项研究中,我们进行了细胞活力计数(Cell Counting Kit-8,CCK-8),测定硼替佐米对腺样囊性癌细胞增殖的影响,并通过流式细胞术定量分析腺样囊性癌细胞的凋亡情况。我们应用蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB)和实时定量聚合酶链反应法(Quantitative Real-time,RT-PCR)来观察 Beclin-1,LC3 和 P62水平的表达。通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色,观察自噬小体及自噬水平的变化。实验结果:1.CCK-8结果显示,蛋白酶体抑制剂硼替佐米以浓度依赖方式降低腺样囊性癌细胞系ACC-83的活性,细胞流式分析表明硼替佐米诱导腺样囊性癌细胞ACC-83的凋亡。2.通过透射电子显微镜可以直观的观察到,加入硼替佐米后的实验组中双层膜组成的自噬体样结构数量明显增加,表明产生自噬小体。与空白对照组对比,实验组胞浆中与LC3相连的荧光点数增多,表明硼替佐米可以诱导自噬。进而通过WB、RT-PCR定量分析P62、Beclin-1、LC3的蛋白水平,WB结果显示随着硼替佐米浓度的增加,P62、LC3-Ⅰ蛋白表达水平下降,LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平升高,此外RT-PCR也证实了这一结论。3.在加入自噬抑制剂3-MA(3-Methyladenine)后,通过观察细胞活力检测结果及流式细胞术结果分析可知,蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合3-MA增强了同样浓度条件下的硼替佐米对腺样囊性癌细胞ACC-83的增殖抑制作用,诱导凋亡作用也增强了。结论:总结实验数据结果证明了硼替佐米对腺样囊性癌细胞ACC-83的增殖起到抑制作用,并诱导了 ACC-83细胞的凋亡及自噬。此外,自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体抑制剂硼替佐米联用可以增强对腺样囊性癌细胞ACC-83的凋亡作用。靶向蛋白酶体联合自噬抑制途径可能是腺样囊性癌治疗的有效治疗方法之一。