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第一部分基于TCGA数据库构建肺腺癌预后相关的microRNA风险模型目的:肺癌是全球范围内肿瘤致死的首要因素,尽管近年来诊断方法及治疗手段有了较大的提高,其预后仍然没有得到显著的改善。miRNAs(microRNAs,微小RNAs)是一类短小非编码RNAs,能够在转录后水平发挥重要的调控作用,其异常表达参与了肿瘤的发生与发展。越来越多的证据表明,miRNAs有望成为新的肿瘤标志物,包括肿瘤的预后。本研究旨在寻找LUAD(lung adenocarcinoma,肺腺癌)特异性的预后相关miRNAs,为LUAD患者的预后预测及个性化治疗方案的制定奠定一定的工作基础。方法:1.下载TCGA肿瘤数据库中522例LUAD患者的miRNA-Seq数据及详细的临床数据,并进行LUAD组织与癌旁正常组织中差异miRNAs分析。2.将患者随机分为训练集及测试集,在训练集中利用LASSO&COX回归模型进行LUAD预后相关miRNAs的筛选,并构建基于miRNAs表达谱的线性风险模型预测患者的预后。3.分别在测试集和总体样本中对风险模型预测患者预后的有效性进行验证。4.单因素及多因素COX回归分析miRNAs风险模型与其他临床变量的相关性。结果:1.相比于癌旁正常组织,LUAD组织中共筛出72个显著差异表达的miRNAs(差异表达倍数>2,且调整后的P值<0.05),其中表达量上调的miRNAs有45个,表达量下调的miRNAs有27个。2.在训练集中确定了 7个与LUAD患者总生存期相关的miRNAs,并基于7个miRNAs构建了预后风险模型,风险评分=(-0.109×miR-101-3p的表达量)+(-0.455×miR-148a-3p 的表达量)+(0.146×miR-192-5p 的表达量)+(0.179×miR-193b-3p 的表达量)+(0.383×miR-505-3p 的表达量)+(0.212×miR-584-5p 的表达量)+(-0.06×miR-99a-5p 的表达量)。3.在训练集、测试集及总体样本中,高风险组患者与低风险组患者相比总体生存时间均显著降低(所有P值<0.05)。4.多因素COX回归分析显示,风险模型在训练集、测试集及总体样本中均是一个独立的预后因子(训练集:HR=1.97,P=0.02;测试集:HR=1.927,P=0.009;总体:HR=1.909,P=0.001)。结论:1.miR-101-3p、miR-148a-3p 及 miR-99a-5p 与 LUAD 患者的预后呈正相关;miR-192-5p、miR-193b-3p、miR-505-3p 及 miR-584-5p 与 LUAD 患者的预后呈负相关。2.基于以上7个miRNAs构建的风险模型能够很好地将LUAD患者分为预后不良的高风险组和低风险组,且独立于患者临床变量预测患者的预后。第二部分MiR-101-3p靶向TGFA在肺腺癌中发挥抑癌作用的初步研究目的:异常表达的miRNAs在肿瘤中发挥着双重作用,既能促进又能抑制肿瘤的发生与发展,同时与其靶基因共同构成了一个复杂的网络调控着肿瘤的进展。越来越多的证据表明miR-101-3p在肿瘤中呈异常表达的状态,包括LUAD。然而,miR-101-3p在LUAD中的功能及其潜在的分子机制仍需进一步阐明。方法:1.下载TCGA及GEO数据库中LUAD相关的miRNAs测序及芯片数据,整合分析miR-101-3p在LUAD组织中的表达水平。2.采用荧光定量PCR技术在细胞水平验证miR-101-3p的表达水平。3.采用CCK-8、克隆形成、细胞划痕、Transwell细胞侵袭实验检测过表达miR-101-3p后LUAD细胞增殖、迁移及侵袭等生物学功能的变化。4.采用TargetScan、miRanda、PITA及RNA22四个靶基因预测数据库对miR-101-3p的靶基因进行预测,并对靶基因进行功能及通路的富集分析,以确定miR-101-3p的最佳下游靶基因。5.运用荧光定量PCR技术及western blot技术在RNA及蛋白水平检测过表达miR-101-3p后TGFA的表达水平变化。6.利用TCGA及Kaplan-Meier plotter两个数据库分别分析TGFA在LUAD组织中的表达水平,及其与LUAD患者预后的相关性。结果:1.在 TCGA 及 3 个 GEO 数据集(GSE74190、GSE51853、GSE48414)中,与正常肺组织相比,LUAD组织中的miR-101-3p均呈显著低表达状态(所有P值<0.001)。2.与正常肺上皮细胞BEAS-2B相比,LUAD细胞株A549及H1299中的miR-101-3p均呈显著低表达状态(所有P值<0.001)。3.过表达miR-101-3p后LUAD细胞A549的增殖、迁移及侵袭能力均受到了显著的抑制(P<0.05)。4.TGFA作为miR-101-3p的最佳预测靶标,在过表达miR-101-3p后,其RNA水平及蛋白水平均显著下调(P<0.01)。5.LUAD组织中TGFA呈高表达状态,且高表达的TGFA与患者的不良预后相关(HR:1.44;P=0.0023)。结论:miR-101-3p在LUAD中能够通过靶向调节TGFA抑制LUAD细胞的增殖、迁移及侵袭。