木兰科(Magnoliaceae)植物是珍贵的园林绿化树种,主要集中分布于我国东南至西南部,向东北及西北地区逐渐减少,其抗寒不常绿,常绿不抗寒的特点极大地限制了这一珍贵树种在我国北方城市中的应用,低温冻害是木兰科植物向北方高纬度地区引种的主要限制因子。因此,筛选抗寒性强的常绿木兰科树种,研究其在低温条件下的抗寒生理和分子机制,将为今后更加系统深入地研究木兰科植物抗寒相关调控基因和耐寒品种的分子选育提供理论基础和优良储备基因,对将该物种向更高纬度地区引种栽培,改善我国北方城市冬季萧条的园林景观具有重要意义。本研究通过资料分析、标本鉴定、野外调查和资源采集等方法,全面了解我国木兰科植物的资源概况和分布格局,进一步对湖南省木兰科植物的资源状况和地理分布进行了研究。以采穗嫁接和实生苗种植的方式在我国木兰科植物的主要栽培区收集在地理分布北缘、海拔高度上限生长的常绿木兰科树种,建立常绿木兰科植物种质资源库。对抗寒性状表现优良的树种采用石蜡切片技术和荧光成像显微系统进行叶片解剖结构观察,阐明叶片结构与抗寒性的关系;对抗寒生理生化指标进行测定分析,运用隶属函数法对抗寒性进行综合分析与评价,筛选出抗寒性强的树种。为深入解析木兰科植物的抗寒机制,选用抗寒性强的乐东拟单性木兰(Parakmeria lotunensis)的2年生扦插幼苗为材料,进行0℃低温胁迫不同时间的生理指标测定和叶片解剖结构观察;同时基于RNA-seq测序技术(Illumina HiSeqTM4000)对0℃低温胁迫Oh、2h、6h和24h的乐东拟单性木兰进行转录组测序,对测序结果进行质量评估、差异基因分析和功能注释;挖掘乐东拟单性木兰响应低温胁迫信号的关键转录因子和应答基因,探究乐东拟单性木兰响应低温胁迫的基因表达脉络和调控机理;利用qRT-PCR技术对候选差异基因进行验证和分析。主要结果如下:1.湖南省木兰科植物有6属39种(含1亚种,3变种),占国产属、种数54.5%、24.38%。在湖南省46个县有分布,集中分布在湘南、湘西南、湘西北地区;垂直分布集中在海拔500～1500m范围内,水平分布中心在北纬28°～26°和东经108°47’～111°之间;湖南省与广东、广西的木兰科物种相似性系数分别为58.46%和55.42%,其次为贵州、江西和四川,与云南的相似性系数最低。2.收集保存了常绿木兰科植物种质资源202份,建立1个常绿木兰科植物种质资源库。根据越冬适应性和花期物候期性状观察初步优选乐东拟单性木兰(Parakmeria lotungensis)、六瓣含笑(Michelia martini’Tiny’)、阔瓣含笑(M.platypetala)、峨眉含笑(M.wilsonii)、杂交含笑(M.martinii’Tiny’ ♀ ×M.doltsopa♂)、红花深山含笑(M.maudiaevar.rubicunda)6种抗寒性状表现良好的树种作为下一步研究的材料。3.对6种常绿木兰科植物叶片进行石蜡切片和荧光显微成像系统观察,发现6种木兰科植物叶片表皮细胞1～2层,垂周壁略呈波浪状,栅栏组织细胞1～3层,栅栏组织厚度、栅海比和主脉厚度可作为6种木兰科植物抗寒性评价的主要叶片结构指标。4.6种常绿木兰科植物进行生理生化指标测定分析表明,6种常绿木兰科植物的低温LT50在一10.64℃～-22.06℃;各树种随处理温度的降低,叶片可溶性蛋白(SP)含量、脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物歧化酶(POD)活性呈先升高后降低的变化趋势,可溶性糖(SS)和丙二醛含量(MDA)则不断积累。相对电导率(REC)、MDA、SP、SS和Pro含量可作为6种木兰科植物抗寒性评价的关键生理指标。抗寒性从强到弱依次为乐东拟单性木兰>六瓣含笑>阔瓣含笑>杂交含笑>峨眉含笑>红花深山含笑。5.构建了乐东拟单性木兰0℃低温胁迫(Oh、2h、6h、24h)的4个cDNA文库,共产生了 238.067×106个高质量的Clean reads,所有的Clean reads组装成273252条非冗长Unigenes,平均长度为590.52 bp,E90N50序列长度达1144bp,碱基错误率<1%,total BUSCO为100%,测序数据可靠,重复性、完整性高。注释到公共数据库的Unigenes有72599个,占所有Unigenes比例的26.57%,其中注释到Uniprot、Pfam、GO、KEGG、Pathway、eggNOG 和 Nr 数据库的 Unigenes 分别有 70624、25189、49622、9079、5819、6139 和 69070 个。6.根据阈值qvalue<0.05且|log2FoldChange|>1,对乐东拟单性木兰转录组测序产生的Unigene进行差异基因筛选,发现在sOh vs s2h、sOh vs s6h、sOh vs s24h分别有10753、18364、19231个差异基因表达,其中分别有5174、9222和8956个基因表达上调,以及5581、9144和10277个基因表达下调。s2h vs s6h和s2h vs s24 h分别有3373和2146个基因上调表达,以及1843和3433个基因表达下调;s6h vs s24 h分别含有1280个基因表达上调和1958个基因表达下调。基于公共基因数据库BLAST比对和KEGG pathway分析,发现Pfam结构域注释以富含亮氨酸重复家族(LRR)、ATPase家族和蛋白激酶家族最多,分别有3544、2369和2173条Unigenes;GO数据库注释到生物学进程、细胞组分和分子功能三方面的Unigenes分别有47,705,34,675和67,917条(41.85%),这些差异基因显著富集在光合作用、压力应激反应、氧化应激反应、谷氨酸酶代谢、水解酶活性、脂质结合、蛋白激酶、氧化还原酶活性、转移酶活性和细胞壁组织等条目。KEGG pathway注释最多的是代谢途径(6299)条,其中与碳水化合物代谢有关的Unigenes最多(1401条),显著富集在淀粉与糖代谢途经;与氨基酸代谢有关的Unigenes有777条,显著富集在精氨酸和脯氨酸代谢、喹啉生物碱、丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸代谢等途径;与脂质代谢相关的Unigenes有681条,显著富集在脂肪酸伸长等途径。参与环境信息处理过程的Unigenes有1337条,显著富集在丝裂原活化蛋白激酶信号通路(ko04010)和磷脂酶D信号通路(ko04072)等信号转导途径。7.基于生理生化和转录组数据,初步挖掘与乐东拟单性木兰相关的关键蛋白激酶、转录因子和应答基因,阐明其在响应低温胁迫过程中的功能和调控机理。低温首先诱导其细胞膜发生改变(LRR_TPK,FAD3,LEA5,FAO),通过Ca2+、MAPK,PLD,cMAP和ABA信号转导途径和相关蛋白激酶(MAPPP3R,LRR_RLK,ATPase,CDPK28)激活抗寒相关转录因子(WRKY33,Myb4,APL,bZIP,NAC)和下游抗寒相关基因的表达,包括清除活性氧(ROS)的抗氧化酶基因([Cu_Zn]SOD,CAT,POD,LOX2S,GR)、淀粉合成和糖代谢相关基因(Beta-amylase,GTs,GPA1,RAC)、脯氨酸代谢相关基因(PRODH,HRGP)和其他次生代谢相关基因(CytP450,SHSP,ACBP,LTP2)的表达,进一步调节细胞代谢的动态平衡,提高乐东拟单性木兰的抗寒性。8.挑选16个差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果表明,随低温处理时间的延长,这16个基因的相对表达量有四种动态表达模式,分别为RAC,SHHSP,PLCPs和FAO基因在处理2h下调表达后持续上调表达;β-amylase,CTs,LOX2S,LRR_RLK,ACBP,LEA5,WRKY33和[Cu_Zn]SOD基因呈持续上调的表达模式;FAD3,Myb4和TP2基因在低温处理6h前上调表达之后下调表达;ATPase在低温处理2h上调表达之后下调表达。这16个差异基因的qRT-PCR相对表达量(△△CT)与转录组测序RNA-Seq测序相对表达量(FPKM)的动态变化趋势基本一致,进一步验证了乐东拟单性木兰转录组测序数据的重复性和可靠性。