[背景和目的]肝癌是一种恶性程度高、早期浸润和转移性强的肿瘤，早期诊断是降低肝癌病死率的关键。甲胎蛋白（AFP）是肝细胞癌（HCC）筛查、诊断的经典标志物，但是AFP对于HCC的诊断有很大的局限性，特别是在HCC的早期诊断中价值不高。近年来发现的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、高尔基蛋白73（GP73）、甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）、异常凝血酶原（DCP）和转化生长因子β（TGF-β）等血清肿瘤标志物，在HCC早期诊断方面都有其优势和局限性，在血清AFP<200ng/ml的HCC患者中，这些血清标志物单独或者不同组合的诊断价值仍不清楚。此外，越来越多的研究提示GPC3既可以作为HCC的诊断标志物又有望成为HCC免疫治疗的潜在靶点。本课题的目的是明确血清肿瘤标志物单独及联合检测诊断肝细胞癌的价值，研究HCC和肝硬化患者中GPC3肽特异性T细胞反应及其相关因素，从而为HCC的早期诊断、筛查和免疫治疗提供一定的理论依据。一、血清GPC3、GP73、TGF-β2、AFP、AFP-L3和DCP单独及联合检测诊断肝细胞癌的价值【材料和方法】研究对象包括99例HBV相关肝癌患者、47例肝硬化患者、25例活动期肝炎患者和25例健康人。ELISA方法检测血清中GPC3、GP73、TGF-β2的浓度，免疫荧光液相结合分析法测定血清中AFP浓度、AFP-L3百分比和DCP的水平。【结果】1.健康人为对照组，分析血清标志物单独诊断HCC的价值根据标志物在肝癌组和健康人群血清中的水平，分别绘制各自的接受者工作特征曲线（ROC曲线），ROC曲线下面积：AFP和DCP都是0.85，AFP-L3、GPC3和GP73都是0.8， TGF-β2为0.78。确定的最佳临界值分别为：AFP>200ng/ml、AFP-L3>15%、DCP>110mAU/ml、GPC3>1.5ng/ml、GP73>2.6IU/ml和TGF-β2>1300pg/ml。血清DCP、GPC3和AFP-L3的敏感性分别为66%、64%和57%，特异性都是94%，阳性似然比与阴性似然比的比值比（OR值）分别为30.4、26.8和20.8。在特异性相等（94%）的情况下，血清DCP、GPC3或者AFP-L3单独诊断HCC的价值高于血清AFP（敏感性为52%，OR值为17）。2.肝硬化患者为对照组，分析血清标志物单独及联合检测诊断HCC的价值2.1单一血清标志物：血清DCP>110mAU/ml的OR值为13.06，在6种标志物中最高，其阳性预测值和阴性预测值分别87.23%和65.66%；血清GPC3>1.5ng/ml的OR值为11.88，略低于DCP，其阳性预测值和阴性预测值分别为89.36%和58.59%。血清AFP>200ng/ml的阳性预测值虽然达到91.49%，但是OR值只有8.96，低于GPC3和DCP的OR值；血清AFP-L3、GP73和TGF-β2的OR值（4.43、0.87和1.71）、阳性预测值（77.27%、53.19%和68.09%）和阴性预测值（56.57%、43.43%和44.44%）都低于血清DCP和GPC3。在肝硬化患者为对照组的分析中，血清DCP或者GPC3作为HCC标志物的诊断价值和筛查价值高于AFP、AFP-L3、GP73和TGF-β2。2.2血清标志物联合检测2.2.1两种标志物的组合：血清AFP+DCP的OR值为22.57，在11个2种标志物组合中最高，其阳性预测值为91.86%，阴性预测值为66.67%；GPC3+DCP的OR值略低，为18.82，阳性预测值为89.47%，阴性预测值为68.89%。其它9个2种标志物组合的阳性预测值、阴性预测值和OR值较单一血清标志物没有优势。2.2.2三种标志物的组合：血清AFP+GPC3+DCP的OR值为32.73，在7个3种标志物的组合中最高，其阳性预测值为89.11%，阴性预测值为80%。其它6个3种标志物组合的OR值、阳性预测值和阴性预测值与2种标志物组合类似。单一标志物、2种和3种标志物组合的肝癌平均检出率分别为52.4%、71.1%和82.1%，2种或3种标志物组合的肝癌检出率显著优于单一标志物（p=0.012和p<0.001）。血清AFP联合GPC3和DCP的肝癌检出率高达90%，显著高于2种标志物组合的平均检出率（p<0.01）。在肝硬化患者为对照组的分析中，血清HCC标志物单独和联合检测的诊断和筛查价值比较：(AFP+GPC3+DCP)>(AFP+DCP)>(GPC3+DCP)>DCP>GPC3。3.肝硬化患者为对照组，分析血清标志物单独和联合检测在AFP≤200ng/ml肝细胞癌患者中的诊断价值3.1单一血清标志物：血清DCP>110mAU/ml的阳性预测值和阴性预测值分别85.37%和69.49%，敏感性和特异性分别为66.04%和87.23%；血清GPC3>1.5ng/ml的阳性预测值和阴性预测值分别为86.11%和64.62%，敏感性和特异性分别为57.41%和89.36%；AFP-L3、GP73和TGF-β2的阳性预测值、阴性预测值、敏感性和特异性低于DCP或者GPC3。3.2血清标志物联合检测：在2种标志物组合中，GPC3+DCP的阳性预测值为81.48%，阴性预测值为75.61%，敏感性为81.48%，特异性为75.61%；没有发现其它5个2种标志物组合或2种3个标志物组合的阳性预测值和阴性预测值高于GPC3+DCP。单一标志物、2种和3种标志物组合的肝癌平均检出率分别为52.2%、74.1%和75.9%，2种或3种标志物组合的肝癌检出率显著优于单一标志物（p=0.028和p=0.016）。在肝硬化患者为对照组的分析中，血清标志物单独和联合检测诊断AFP≤200ng/ml肝细胞癌的价值比较：(GPC3+DCP)> GPC3>DCP。4、血清TGF-β2与病因和血清GPC3：乙型肝炎肝硬化组血清TGF-β2水平（679.3±114.8pg/ml）显著低于肝癌组（1546±193.2pg/ml）和乙型肝炎合并酒精性肝硬化组（905.2±96.20pg/ml）（p<0.01和p<0.05）。提示酒精因素可能导致乙型肝炎肝硬化患者血清TGF-β2升高，从而增加发生肝癌的风险。血清GPC3>1.5ng/ml和GPC3≤1.5ng/ml的肝癌患者中，血清TGF-β2水平（1632±298.9pg/ml和1422±206.6pg/ml）没有显著性差异。提示肝癌患者血清GPC3与TGF-β2的相关性尚不明确，需要进一步的研究。【结论】1.作为肝细胞癌诊断标志物，血清DCP、GPC3或者AFP-L3单独检测的诊断价值优于AFP。2种或者3种血清标志物联合检测诊断肝细胞癌的价值高于单一血清标志物，其中最佳的组合方式是联合检测血清AFP、GPC3和DCP。2. AFP≤200ng/ml的肝细胞癌患者，血清GPC3联合DCP检测的诊断价值高于单一标志物及其它2种或者3种标志物的组合，是最佳的诊断和筛查指标。二、GPC3肽特异性T细胞反应及其相关因素【材料和方法】25例乙型肝炎相关性肝癌患者、22例乙型肝炎肝硬化患者、22例健康对照人群。在抗CD152抗体存在或者不存在的情况下，ELISPOT检测PBMC中GPC3肽特异性T细胞反应率和反应强度。流式细胞计数检测T淋巴细胞亚群，ELISA检测血浆中的CD152抗原。【结果】1. GPC3肽诱导的特异性T细胞反应：GPC3298-306和GPC3144-152反应率分别为33.3%和26.7%，平均反应强度为106SFU/106PBMC和203SFU/106PBMC，高于GPC3155-163和GPC344-52；抗CD152抗体共刺激时能够增加反应率（19.5%比16.1%），但是降低了反应的强度（58.75±13.7SFU/106PBMC比109.1±31.9SFU/106PBMC）。肝癌、肝硬化患者和部分健康人外周血中存在GPC3肽特异性T细胞，GPC3298-306和GPC3144-152诱导的特异性T细胞反应较好，封闭CD152可能增加GPC3肽特异性T细胞的检出率，但是可能会降低原有的免疫强度。2.外周血T淋巴细胞亚群：肝癌组和肝硬化组CD3+、CD3+CD4+、CD4+CD25+FoxP3+、 CD8+CD57+CD27+T细胞水平高于对照组，而CD4+CD28+CD27+和CD3+CD8+T细胞水平低于对照组。肝硬化组CD8+CD28-CD27+T细胞水平低于肝癌组和对照组。CD8+GPC3-Tetramer+T细胞在三组中没有显著性差异。肝癌和肝硬化患者T淋巴细胞亚群的特点是CD3+CD4+T细胞和Treg细胞增加，CD8+T细胞降低， CD28-的CD4+和CD8+T细胞比例较高。肝硬化患者GPC3肽特异性T细胞反应强度较高可能与CD8+CD28+T细胞较多有关。3.血清GPC3和CD152与T细胞亚群：血清GPC3>1.5ng/ml的肝硬化患者有较高比例的CD4+CD28+CD27+T细胞和较低比例的CD8+GPC3-Tetramer+T细胞，但在血清GPC3>1.5ng/ml的肝癌患者中， CD8+和CD8+GPC3-Tetramer+T细胞的比例较高而CD8+CD28+CD27-T细胞的比例较低。肝癌组、肝硬化组和对照组血浆CD152抗原平均浓度分别为4.25±0.23ng/ml、4.14±0.12ng/ml和4.02±0.04ng/ml，各组间比较没有统计学差异（p>0.05）。GPC3>1.5ng/ml和GPC3<1.5ng/ml肝癌患者的血浆CD152抗原浓度分别为4.45±0.43ng/ml和4.01±0.08ng/ml，没有统计学差异。肝硬化患者血清GPC3与CD8+GPC3-Tetramer+T细胞负相关，而肝癌患者血清GPC3与CD8+GPC3-Tetramer+T细胞呈正相关。肝癌和肝硬化患者外周血中CD4+CD28-和CD8+CD28-T细胞比例较高可能不是其竞争性分子CD152增加的结果。【结论】1. GPC3具有免疫原性，可能成为肝细胞癌免疫治疗中的潜在靶点。肝细胞癌和肝硬化患者外周血中存在GPC3肽特异性T细胞，部分健康人群中可能存在低水平的GPC3肽特异性T细胞。ELISPOT实验中加入抗CD152抗体可能有助于增加GPC3肽特异性T细胞的检出率，但是CD152在GPC3肽诱导的特异性T细胞反应中的作用需要进一步的研究。2.肝细胞癌和肝硬化患者T淋巴细胞的特点是CD4+T细胞和Treg细胞比例增加、CD8+T细胞比例降低，CD28-的CD4+和CD8+T细胞比例增加。T细胞亚群的改变可能是导致肝硬化患者易发生肝癌的因素之一。3.高浓度血清GPC3可能会导致肝硬化和肝细胞癌患者T细胞亚群发生不同的变化，其机制和意义需要进一步的研究。