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目的本课题旨在研发一种新型、无创的肿瘤治疗方法—中频交变电流技术治疗人乳腺癌。在优化第三代自主研发的治疗仪器最适参数的基础上,从细胞和动物水平上完成对该治疗方法的安全性和有效性评价,并初步探讨中频交变电流抑制肿瘤生长的机制和增加化疗药物敏感性的可能。为新型、安全、有效的物理治疗技术的进一步研究提供实验及理论基础。方法1.中频交变电流体外安全性评价根据中华人民共和国国家标准GB/T16886.5(医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验)的相关规定,以小鼠成纤维细胞L929为研究对象,施加50mA不同频率的中频交变电流,每天30min,连续3天,3天后显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,评价中频交变电流的体外生物安全性。2.中频交变电流人乳腺癌细胞(MCF-7)最佳抑制参数筛选以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,根据单一变量法,施加不同参数的中频交变电流,包括频率、电流大小、持续时间,连续3天,3天后CCK-8法检测细胞存活率,评价中频交变电流的体外有效性,并确定后续实验的最佳治疗参数。3.中频交变电流抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的机制探讨通过阅读相关文献的学习,选取不同研究方向,探讨中频交变电流抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的机制。首先,进一步确定中频交变电流对MCF-7细胞增殖的影响,包括生长曲线、细胞周期、分裂代数,分别使用的方法是CCK-8法、荧光标记后流式细胞仪检测；细胞周期用PI标记,分裂代数研究用CFSE标记。施加中频交变电流后,检测细胞周围环境pH值、温度及细胞内活性氧ROS水平的变化。瑞氏吉姆萨复合染色观察人乳腺癌(MCF-7)整体细胞形态的影响；扫描电镜(SEM)观察MCF-7细胞表面结构的变化；透射电镜(TEM)观察细胞内部结构的变化。硝酸镧示踪法观察MCF-7细胞膜通透性改变；Rho123标记后流式细胞仪检测MCF-7细胞线粒体膜电势的改变。4.中频交变电流增加人乳腺癌细胞(MCF-7)药物敏感性的研究以人乳腺癌细胞耐药变异株MCF-7/Adr为研究对象,施加最适参数的中频交变电流刺激。CCK-8法检测不同浓度的化疗药物下的存活率,从而比较中频交变电流对耐药株IC50和耐药指数的影响,验证其是否有药物增敏作用。根据现有研究,选取中频交变电流增加人乳腺癌细胞(MCF-7)药物敏感性的机制研究方向—对糖蛋白P-gp表达量的影响。使用的实验方法为荧光标记后激光共聚焦成像、流式细胞仪检测和Western Blot。5.中频交变电流对人乳腺癌(MCF-7)荷瘤裸鼠的抑制作用在BABL/c裸鼠右后肢皮下接种人乳腺癌细胞(MCF-7),建立荷瘤鼠模型。肿瘤体积达到实验要求后将裸鼠随机分为2组：对照组和实验组。实验组每天施加中频交变电流30min,连续28天。隔天记录裸鼠体重和肿瘤体积,实验终止时解剖荷瘤鼠,病理组织学分析。结果1.中频交变电流具有良好的生物安全性体外生物安全性实验结果为0级或1级毒性,证明中频交变电流无细胞毒作用,不影响正常细胞L929的形态及增殖。体内生物安全性评价实验中,施加电流刺激后的裸鼠体重无明显变化,重要脏器HE染色未见明显病理性变化。2.中频交变电流可以抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖CCK-8法结果显示,中频交变电流对人乳腺癌细胞(MCF-7)有抑制作用,最高抑制率约为20%。此时的治疗参数为100kHz,50mA。但是该实验参数在体内实验结果未得到预期结果,电流刺激的裸鼠肿瘤体积未见明显减少,造成该结果的原因有待进一步探讨。3.中频交变电流抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的机制中频交变电流能够抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖,连续作用3天后,细胞凋亡率约10%,G0/G1期细胞数量增加而s期细胞数量减少；细胞分裂代数滞后2代。说明中频交变电流不仅诱导细胞凋亡,还能影响细胞周期各期细胞分布。与直流电疗法不同,中频交变电流不改变细胞生存环境的pH值和温度,不产生氧化性损伤。细胞形态观察结果显示,中频交变电流刺激后的MCF-7细胞体积增大、表面微绒毛卷曲甚至消失,细胞内有空泡,线粒体明显肿胀。硝酸镧示踪法和Rho123荧光标记结果均显示,电流刺激后的MCF-7细胞膜通透性增大。4.中频交变电流可增加化疗药物的作用效果中频交变电流能够降低人乳腺癌耐药株(MCF-7/Adr)对阿霉素的IC50和耐药指数,证明中频交变电流有一定的药物增敏作用；中频交变电流和阿霉素联合作用,有次加或协同作用,显著提高化疗药物的治疗效果。耐药蛋白P-gp表达量有所下降,但无统计学意义,猜测中频交变电流的增敏机制可能与细胞膜通透性改变有关。结论中频交变电流可安全有效地抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖,其作用机制可能是改变了细胞膜结构和通透性,影响细胞周期,诱导细胞凋亡。但不改变细胞生存环境的pH值和温度,不产生氧化性损伤。相同的治疗参数下,中频交变电流有一定的增敏化疗效果,但机制尚不明确。中频交变电流技术为治疗肿瘤的研究提供了新的思路。