无论是在畜牧业还是在人类医学领域，抗生素已经成为临床治疗病原感染的有力武器。同时抗生素还可作为畜禽饲料添加剂在畜禽疾病预防和促生长方面发挥重要作用。但是，抗生素的乱用与滥用，造成了许多细菌产生耐药性，且耐药菌株出现的速度已远远超过抗生素新药的开发速度，使抗感染治疗陷入耐药菌的危机中；抗生素作为饲料添加剂的广泛使用，也严重破坏了畜禽肠道的微生物平衡，而且在畜产品体内积蓄残留，带来了严重的公共卫生隐患。有鉴于此，“无毒，无残留，无耐药性”是新一代抗菌制剂的发展趋势和要求。抗菌肽（antibacterial peptides）是生物体免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，是生物体先天免疫的重要组成成分（Boman，1991）。由于其独特的抗菌机制，不会诱发细菌的耐药性，成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。目前抗菌肽的制备主要有生物材料提取、化学合成和基因工程表达3种方法。抗菌肽在生物组织中含量低，且分离程序烦琐，获得的样品仅仅用于氨基酸序列分析和初步的抗菌试验，难以满足应用需要；化学合成法合成差错随着目的肽段的增大而增加（一般超过50个氨基酸残基的肽段难以用化学合成法合成），并且其合成价格昂贵；基因工程方法是目前大量表达抗菌肽使其成为新一代肽类抗菌药物更为现实的途径，显示出其广阔的前景。多种抗菌肽已在不同的表达体系中得到表达，如天然抗菌肽天蚕素A和B已在昆虫系统中得到表达；柞蚕抗菌肽D和绿蝇抗菌肽在酵母系统中得到表达；天蚕抗菌肽A在真核系统中得到表达等等。本研究的目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研究猪小肠抗菌肽cecropin P1及其体内外抗菌活性，为重组抗菌肽cecropin P1的工程化生产和畜牧养殖业及公共卫生健康奠定基础。本研究主要从以下几个方面展开。1选用毕赤酵母偏好密码子设计并人工合成猪小肠抗菌肽cecropin P1基因，全长117bp。基因N端引入a-交配信号肽kex 2裂解位点，以保证表达抗菌肽具有天然N端；C端引入谷氨酰胺增加抗菌肽的酰氨化程度，以增强广谱抗菌活性。此外，基因的两端分别引入两个限制性酶切位点XhoⅠ和XbaⅠ。抗菌肽基因被克隆入pPICZa-A质粒，成功构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZa-A-cecP1。将重组质粒SacⅠ线性化后电击转化Pichia pastoris SMD1168。在AOX1（醇氧化酶）启动子调控下，类似天然抗菌肽大小的目的蛋白获得分泌表达。初步抑菌活性测定显示其对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（CowanⅠ）、鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌具有很强的抑杀活性。2 SMD1168菌株由于蛋白酶A和羧肽酶Y活性全部缺失，仅存部分蛋白酶B活性，这样非常有利于发酵液中重组抗菌肽表达物的稳定。笔者对cecropin P1重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了表达优化和生物学活性研究，结果显示当含有重组酵母菌的BMGY培养液OD₆₀₀达到7～8时转接pH值为6.0 BMMY培养基，每24h补加0.5％甲醇，并于28℃培养72h后，抗菌肽cecropin P1可获得高效表达。根据琼脂孔扩散法，对重组抗菌肽的酸、碱、热稳定性和抑菌效价等生物学特性进行检测。3以昆明种小鼠为对象，初步研究了重组抗菌肽cecropin P1防治小鼠细菌感染的效果。通过预试验，确定了选用的金黄色葡萄球菌（CowanⅠ）和致病性大肠杆菌K99对小鼠的最小致死剂量(MLD₁₀₀)和抗菌肽体内保护剂量的参考值。在预防实验中，腹腔注射cecropin P1重组抗菌肽240μg的小鼠，2h后分别腹腔注射致死剂量金黄色葡萄球菌（CowanⅠ）和致病性大肠杆菌K99，48h后小鼠存活率分别为87.5％和75％。在治疗实验中，在致死剂量的金黄色葡萄球菌和K99腹腔注射后，重组抗菌肽cecropin P1有一定的治疗效果，48h后小鼠存活率分别为75％和62.5％。表明，cecropin P1重组抗菌肽有较好的体内防治效果。