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体细胞克隆技术是一种具有广阔应用前景的家畜遗传改良技术,故而成为当今生物技术的研究热点。然而,目前体细胞克隆的效率还很低,主要表现在克隆胚胎发育率低,移植后妊娠率低、流产率高、胎盘异常或出生儿体重过大等问题,使得体细胞克隆技术在实际生产应用中受到限制。有研究表明,异常的表观遗传修饰是克隆胚胎效率低的主要原因,而组蛋白乙酰化和DNA甲基化修饰是表观遗传修饰的两个重要方面。因此,本研究系统探讨了组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对水牛体细胞核移植重构胚发育潜能及胚胎表观遗传修饰的影响及其对克隆胚胎合子基因激活的影响,同时研究了Scriptaid对水牛转基因效果的影响,以期进一步提高水牛体细胞克隆和转基因克隆的效率。具体的研究结果如下。1.本研究首先采用醋酸地衣红染色法确定了水牛卵母细胞不同成熟培养时间的核相分布情况,然后利用细胞免疫组化技术和定量PCR技术分别分析水牛卵母细胞组蛋白乙酰化修饰的情况,并探讨Scriptaid对卵母细胞组蛋白乙酰化修饰的影响,从而建立一种检测水牛卵母细胞组蛋白乙酰化修饰相关蛋白和基因表达的技术方法。结果显示：体外成熟培养0h时大约91.8%的卵母细胞处于GV期,培养9h时,有83.3%的卵母细胞发生GVBD;随着成熟培养时间延长,到达15 h时,卵母细胞处在MⅠ期的比率达到72.5%,培养至22 h时,有59.6%的卵母细胞进入M Ⅱ期。水牛卵母细胞体外成熟过程中组蛋白H3K18乙酰化水平从GV期到GVBD期开始升高,MⅠ期突然消失,MⅡ期重新升高,在第一极体上也观察到荧光信号,经500 nmol/L Scriptaid处理水牛卵母细胞24 h,MⅠ期的卵母细胞组蛋白H3K18乙酰化水平显著增强(P<0.05),呈现出从GV期到GVBD期开始升高,到MⅠ时期下降,而后到M Ⅱ期乙酰化水平重新升高的趋势。而CBP, p300和HAT1基因在水牛卵母细胞成熟过程各个时期(GV, GVBD, M I,M Ⅱ)的表达水平呈现出升高的趋势,HDAC1和HDAC2基因的表达水平从GV到MⅡ期显示出先升高后下降的波浪线趋势；而经500 nmol/L Scriptaid处理水牛卵母细胞24 h后,CBP, p300和HAT1基因在各个时期的表达水平显著提高(P<0.05),仍表现出上升的趋势；HDAC2基因的表达水平在MⅡ期显著地降低(P<0.05),从GV到MⅡ期表现出先升高后下降的波浪线趋势,而HDAC1基因在各个时期的表达呈现出从GV期到MⅠ期先下降,而后到MⅡ期升高的趋势。2.研究了Scriptaid处理水牛SCNT胚胎后对其发育能力及组蛋白乙酰化修饰的影响。水牛SCNT胚胎经不同浓度Scriptaid (0,250,500,750 nmol/L)处理12 h后,500 nmol/L Scriptaid处理组的囊胚发育率显著高于未处理组(19.2% vs 10.3%,P<0.05)。当水牛SCNT胚胎用500 nmol/L Scriptaid处理不同时间(Oh,6h,12h,18h,24h,30h和36 h)时,24 h组的囊胚发育率(28.2%)显著高于对照组(13.6%),6h组(15.5%)和12 h组(17.4%)。不同类型胚胎组蛋白H3K18乙酰化修饰和整体DNA甲基化修饰的细胞免疫组化分析发现,SCNT组胚胎各个时期(2-细胞,8-细胞,桑椹胚和囊胚)的H3K18乙酰化水平显著低于IVF组(P<0.05),而DNA甲基化的水平显著高于IVF组和PA组的胚胎(P<0.05),但SCNT胚胎500 nmol/L Scriptaid处理组的各个时期组蛋白H3K18乙酰化水平显著地高于SCNT组(P<0.05),除8-细胞时期外,其它三个时期胚胎乙酰化水平均接近于IVF组的水平(P>0.05),而胚胎整体DNA甲基化修饰水平显著地降低(P<0.05),且其囊胚时期胚胎DNA甲基化水平接近于IVF组(P>0.05)。组蛋白乙酰化(CBP, p300, HAT1, HDAC1和HDAC2)、DNA甲基化(Dnmtl, Dnmt3a和Dnmt3b)和胚胎发育(Oct-4, Nanog, Cx43和Cdx2)相关基因表达水平的荧光定量PCR分析结果显示：Scriptaid处理SCNT胚胎组在8-细胞期的CBP,HDAC1和HDAC2基因表达水平接近于IVF组,Dnmt1, Dnmt3a和Dnmt3b基因的表达水平显著降低(P<0.05), Dnmtl基因表达水平接近IVF组(P>0.05)；在桑椹期的Dnmtl, Dnmt3a和Dnmt3b基因表达水平显著地提高(P<0.05), Dnmtl基因和CBP基因的表达水平接近IVF组(P>0.05)；在囊胚期的Dnmt3a基因表达水平显著降低,Dnmt3a基因和HAT1基因的表达水平接近IVF组(P>0.05)。PA组各个时期胚胎的CBP,p300, HAT1和HDAC1基因表达量处于较高水平。此外,Scriptaid处理SCNT胚胎组的各个时期胚胎的Oct-4基因表达水平显著提高,8-细胞期和囊胚期的Nanog基因、桑椹期的Cx43基因,以及囊胚期的Cdx2基因的表达水平亦显著高于SCNT组(P<0.05),接近于IVF组的表达水平。3.探讨了Scriptaid处理水牛SCNT胚胎对其合子基因激活的影响。采用转录抑制剂25μg/mla-amanition可将水牛胚胎阻滞于8-16细胞时期。透射电子显微镜技术观察各个时期(4-细胞,8-细胞和桑椹期)胚胎细胞核核仁变化情况的结果显示：IVF组胚胎在4-细胞时期核仁呈现出核仁前体(Nucleolus precursor body,NPB)形式,8-细胞时期NPB周围出现网状结构,到桑椹期NPB消失,形成具有转录功能的网状结构；而8-细胞时期的SCNT组胚胎NPB周围没有形成网状结构；但经500nmol/L Scriptaid处理水牛核移植重构胚胎24 h,可观察到8-细胞时期核移植胚胎细胞核中的NPB周围出现低电子密度的网状结构,开始行使转录功能。各个发育时期(2-细胞,4-细胞,8-细胞和桑椹期)胚胎的RNA Pol II蛋白和核纤蛋白Fibrillarin表达细胞免疫组化技术检测结果发现,IVF胚胎在2-细胞和4-细胞时期未检测到RNA Pol II蛋白和核纤蛋白Fibrillarin荧光信号,8-细胞阶段开始发现荧光信号,而SCNT胚胎在桑椹期才开始检测到这两个蛋白的荧光信号,经Scriptaid处理的SCNT胚胎在8-细胞阶段开始检测到RNA Pol II蛋白和核纤蛋白Fibrillarin微弱的荧光信号。胚胎合子基因激活标志基因(eIF-3a和TRC)表达的荧光定量PCR检测结果显示：IVF胚胎的eIF-3a和TRC基因从2-细胞到8-细胞期先升高,从8-细胞到桑椹期开始急剧地降低,而SCNT胚胎的eIF-3a基因从2-细胞到桑椹期呈现一直降低的趋势；经Scriptaid处理的SCNT胚胎,除桑椹期外,其他三个时期的eIF-3a和TRC基因表达水平显著高于IVF组和SCNT组(P<0.05),呈现出波浪形表达趋势,在8-细胞时期表达水平最高；SCNT组以及Scriptaid处理组胚胎的TRC基因表达水平均低于IVF组。4.探讨了Scriptaid对水牛转基因克隆效率的影响。水牛转基因胎儿成纤维细胞用各种浓度(0,250,500,750 nmol/L)的Scriptaid处理不同时间(0,24h,48h,72h)后,经250 nmol/L或500 nmol/L Scriptaid处理72 h的转基因细胞在荧光显微镜下观察到的GFP荧光更强。荧光定量PCR的分析结果亦显示,250 nmol/L Scriptaid处理72 h的转基因细胞,其GFP基因的表达水平显著地高于其它各组的表达水平(P<0.05)。流式细胞仪检测发现,250 nmol/L处理72 h组、500 nmol/L处理48 h或72 h组,以及750nmol/L处理48 h组的GFP-阳性细胞比例显著高于250 nmol/L处理48h组、500 nmol/L和750 nmol/L处理24 h组(79.8%,80.9%,80.1%,80.8%vs 73.2%,73.1%,68.5%,P<0.05),但与对照组和其他处理组之间差异不显著。转基因细胞外源基因EF-1A启动子区的甲基化程度重亚硫酸氢盐—测序检测结果显示：Scriptaid处理显著降低转基因细胞的EF-1A启动子区甲基化水平(P<.05),各处理组之间差异不显著(P>0.05)。用经250 nmol/L Scriptaid处理72 h的水牛转PRL基因胎儿成纤维细胞作为供体细胞构建SCNT胚胎,再用500 nmol/L Scriptaid处理SCNT胚胎24 h,其囊胚发育率显著高于对照组(31.3% vs 20.4%,P<0.05),且其移植后的妊娠率显著提高(22.9% vs 11.1%),并有1头已顺利出生。