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第一部分沉默ECA109细胞中CtBP2的表达后基因芯片检测与分析目的:为了更好的阐明转录辅阻遏因子2(C-terminal binding protein 2,CtBP2)对食管鳞癌ECA109细胞增殖的调控作用,本部分研究在体外合成CtBP2小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的基础上,通过基因芯片分析,筛选出感兴趣的下游目的基因并进行验证。方法:(1)将100nM的siRNA(包括CtBP2 siRNA及阴性对照NC siRNA)与6μL的转染试剂混合,然后加入培养的ECA109细胞中;(2)72h后提取两组细胞中的RNA,进行基因芯片表达谱分析;(3)提取两组ECA109细胞的总蛋白,进行Western blot分析。结果:(1)芯片结果共显示差异基因166个,其中上调基因43个,下调基因123个。在上调基因中,包括成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2,FGF2);(2)Western blot分析结果显示,在siRNA沉默细胞中CtBP2的表达后,FGF2的表达水平也明显下调(*P<0.05)。结论:CtBP2能够调节FGF2的表达,FGF2可能对ECA109细胞的增殖起调控作用。第二部分沉默ECA109细胞中FGF2的对ECA109细胞增殖、迁移和侵袭的影响目的:在应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)的方法成功构建FGF2基因沉默慢病毒载体的基础上,应用嘌呤霉素(Puromycin)筛选出稳定低表达FGF2的食管癌细胞ECA109,进而阐明RNA干扰FGF2后对ECA109细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:(1)根据文献报道,获取针对FGF2的靶向序列(5’-CGAACTGGGCAGTATAAAC-3’),构建慢病毒表达载体并测定滴度;(2)1×105个细胞接种于6孔板中,慢病毒感染体外培养的ECA109细胞(MOI=5),用嘌呤霉素稳筛后用于后续试验;(3)2X103个细胞接种于96孔板中,于培养后的第1、2、3、4、5d分别于培养孔中加入10μL的CCK-8试剂,酶标仪下检测OD450数值;(4)1X105个细胞接种于6孔板中,培养24h后,收集各组细胞用流失细胞仪分析各组细胞周期变化;(5)5X104个细胞接种于24孔板中,培养24h后,用50μM的EdU孵育4h,检测EdU阳性细胞的比例;(6)2×104个细胞接种至Ibidi迁移小室(35mm-μ Dish)的两侧接种孔中,当细胞密度接近90%时,移去Insert并在迁移小室中添加500μL的细胞培养液,于24h和48h后摄片分析;(7)2 X104个细胞接种于Matrigel预处理Transwell迁移系统(8 μm)的上层小室,培养16h后吸去上层小室内的培养液,结晶紫染色后进行计数;(8)1X 105个细胞接种于6孔板中,培养48h后提取总蛋白,Western blot检测p-AKT和p-mTOR的表达变化。结果:(1)在感染慢病毒LV-FGF2-RNAi、LV-scr-RNAi的实验组细胞中可见绿色荧光,而在野生型(Wild Type,WT)对照组中未见绿色荧光;(2)LV-FGF2-RNAi组的ECA109细胞的活力在细胞接种后第2d(48h)即表现出明显降低,并一直延续至接种后的第5d(120h)(*P<0.05);(3)LV-FGF2-RNAi组的细胞S期(21.38 ±0.83%)所占比例明显低于其他两组(WT:31.22±1.02%,LV-scr-RNAi:31.30±1.20%)(***P<0.001);(4)LV-FGF2-RNAi 组的 EdU 阳性细胞所占比例(29.22 ± 1.83%)明显低于其他两组(WT:46.32±1.62%,LV-scr-RNAi:48.95±2.81%)(***P<0.001);(5)在培养24h、48h 后,接种于 Ibidi迁移小室中LV-FGF2-RNA组的细胞迁移的距离明显少于WT组和LV-scr-RNAi组(***P<0.001);(6)LV-FGF2-RNAi组穿过Matrigel预处理上层小室的细胞数目明显减少(WT:132.89 ± 9.20,LV-scr-RANi:122.70 ± 10.27,LV-FGF2-RNAi:83.87±21.96)(**P<0.01);(7)Western blot 结果提示,FGF2RNAi 后 PI3K/AKT 信号通路下游关键信号分子p-AKT及p-mTOR的表达下降(***P<0.001)。结论:通过RNAi的方法降低ECA109细胞中内源性FGF2的表达水平能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力。第三部分外源性FGF2促进ECA109细胞的增殖、迁移和侵袭目的:应用外源性的FGF2,通过检测细胞的生物学功能,以进一步明确FGF2对ECA109细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及可能的机制。方法:(1)2X103个细胞接种于96孔板中,每孔加入培养液100μL,同时加入 2ng/mLL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL 和 100ng/mL 的外源性 FGF2,在培养后的第1、2、3、4、5d分别于培养孔中加入10μL的CCK-8试剂,应用酶标仪检测450nm OD值;(2)1X105个细胞接种于6孔板中,同时加入2ng/mLFGF2和/或100μM LY294002培养24h,收集各组细胞,应用流式细胞仪检测各组细胞周期;(3)5X104个细胞接种于24孔板中,同时加入2ng/mL FGF2 和/或 100 μ M LY294002 培养 24h,再用 50 μ M 的 EdU 孵育 4h,检测 EdU阳性细胞的比例;(4)2×104个细胞接种至Ibidi迁移小室(35mm-μ Dish)的两侧接种孔中,接种孔中的细胞密度接近90%时,移去Insert并在迁移小室中添加500 μ L的细胞培养液,同时加入2ng/mL FGF2和/或100 μ M LY294002,于24h和48h进行分析;(5)2X104个细胞接种于Matrigel预处理的Transwell迁移系统(8μm)的上层小室,下层小室加入2ng/mL FGF2和/或100 μ M LY294002培养12h,结晶紫染色后进行计数;(6)1X105个细胞接种于6孔板中,同时加入2ng/mL FGF2 和/或 100 u M LY294002,培养 48h 后提取总蛋白,Western blot 检测 p-AKT和p-mTOR的表达变化。结果:(1)不同浓度FGF2后的第4d,各组细胞的活力较空白对照组明显增高,但是各个浓度之间未显示出差异;在培养液中加入LY294002后能够明显抑制2ng/mL FGF2对ECA109细胞活力的促进作用;(2)2ng/mL的FGF2能够增加S期细胞的比例,而在联合应用LY294002后,S期细胞的比例明显下调(Ong:37.18 ± 0.54%,2ng:43.52 ± 0.59%,2ng ± LY294002:29.70 ± 0.28%,LY294002:27.25±0.55%)(***P<0.001);(3)加入FGF2 后,EdU 阳性细胞(55.07±1.89%)所占比例明显提高(**P<0.01)。而在联合应用LY294002后,EdU阳性细胞(35.16±2.66%)的比例明显下调;(4)培养液中加入2ng/mL的FGF2,24h后即发现FGF2能够促进细胞的迁移,48h后FGF2的促迁移作用依旧明显;而在培养液中加入PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002后,FGF2对细胞迁移的促进作用被明显抑制;(5)在加入FGF2后穿过Transwell上层小室的ECA109细胞数目(67.33 ±6.33)明显增加(***P<0.001)。而在培养液中加入LY294002后,则明显减少了穿膜细胞的数量(26.33±1.81)。(6)2ng/mL的FGF2能够上调p-AKT和p-mTOR的表达水平,而联合应用LY294002后则明显减弱了 p-AKT和p-mTOR的表达水平。结论:PI3K/AKT信号通路中FGF2对食管鳞癌ECA109细胞细胞的增殖、迁移和侵袭能力的调节作用。