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随着世界经济持续、高速地发展,能源短缺、环境污染等问题日益严重,能源供需矛盾日益突出。作为生产生物柴油的一种方式微藻产油,具有可再生,碳中立和对环境更友好等优点,受到越来越多的关注。微藻能生产包括食物、营养物质、绿色化学物质和生物燃料等符合市场需求的化合物。其中微藻中脂质代谢产生的油脂,可用于生物燃料的生产,具有重要的经济价值。脂质代谢贯穿微藻的全部生命过程,对微藻的生长发育和应对外界胁迫都具有重要意义。微藻与研究较清楚的真菌和陆地植物,在脂质代谢过程方面具有高度的功能相似性。当然,随着微藻脂质代谢相关功能基因逐渐被鉴定,人们发现微藻的脂质代谢也具有区别真菌和陆地植物的独特性。因此,针对微藻的脂质代谢过程的分析具有重要意义。莱茵衣藻是研究脂质代谢过程的模式生物,具有高效的光合作用和TAGs积累能力,已经完成基因组测序,转基因技术也相当成熟,已经通过基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等方法,对质体、内质网和过氧化物酶体中进行的脂质合成和分解过程进行研究。与陆生双子叶模式植物拟南芥相比,微藻的脂质生物合成路径被研究的很少。近年来利用微藻生产生物燃料已经成为研究的热点,其油脂生产潜力巨大远远超过了传统的陆生植物。在植物中参与脂质代谢的主要的蛋白质家族（FAX、LACS、ACBP、LTP和ABC等）成员,也都在莱茵衣藻基因组中编码,但是很多蛋白都没有试验研究进行验证。据研究,拟南芥（Arabidopsis thaliana）中FAX1（Fatty acid export 1）是一种介导质体中脂肪酸输出的一种新的叶绿体内膜蛋白。FAX蛋白质可能是提高植物脂质产量的有力工具。通过对莱茵衣藻FAX基因在脂肪酸转运中的功能进行研究,通过通过构建过表达突变体提高单个细胞中三酰甘油的含量,从而为提高三酰甘油的产量提供依据。1.对包括莱茵衣藻在内的多个物种的FAX序列进行分析。将拟南芥中的FAX基因序列在莱茵衣藻基因组中进行同源分析,发现在莱茵衣藻中有两个拟南芥同源序列,分别命名为CrFAX1和CrFAX2。将拟南芥、甘蓝型油菜（Brassica napus）、大豆（Glycine max）、番茄（Solanum lycopersicum）和水稻（Oryza sativa）等植物和小球藻（Chlorella variabilis）等藻类中的FAX信息进行整理后,分别采用MEGA6对CrFAX系统发育树进行分析和采用MEME对CrFAX保守模块进行分析。并且对NCBI数据库中CrFAX的外显子序列进行分析显示CrFAX1和CrFAX2都有三个外显子。用GeneDoc分析AtFAX和CrFAX蛋白序列证明都具有四个跨膜结构域。用Phyre server对AtFAX和CrFAX的3D模型进行分析证明其空间结构很相似。以上这些序列分析证实CrFAX与其他物种FAX具有相似的结构,说明莱茵衣藻中FAX基因在藻类向植物、原核向真核的进化过程中都是很保守的。用亚细胞定位预测软件Cello和WolfPsort对CrFAX的亚细胞定位进行预测,预测CrFAX1和CrFAX2蛋白定位在质体膜上。2.FAX基因过表达莱茵衣藻的筛选。用PCR对CrFAX1（Cre10.g421750）和CrFAX2（Cre08.g366000）基因进行扩增,其中CrFAX1长度为600bp,CrFAX2长度为366bp。用电转化的方法转入莱茵衣藻,用巴龙霉素（Paromomycin）抗性对阳性转化子进行筛选。对FAX基因过表达莱茵衣藻的RNA进行提取后反转为cDNA。采用qRT-PCR方法对FAX基因过表达莱茵衣藻中FAX基因的表达水平进行分析。其中FAX1基因过表达莱茵衣藻CrFAX1-OX中的FAX1基因表达量较野生型提高44%,FAX2基因过表达突变体CrFAX2-OX中的FAX2基因表达量较野生型提高30%。3.TAP培养条件下,FAX基因过表达莱茵衣藻的生长状况分析。细胞浓度与OD680之间呈正相关,且关系数为R2=0.9978,所以用OD680可以表示藻细胞数。结果显示,CrFAX1-OX和CrFAX2-OX的生长速率都比野生型低,并且在平台期的细胞浓度都较野生型少。4.TAP培养条件下,FAX基因过表达莱茵衣藻的油脂累积含量分析和叶绿素含量分析。通过尼罗红染色法测定FAX基因过表达莱茵衣藻中的中性脂含量。但不同的培养阶段,尼罗红染色后,利用荧光分光光度计测得的相对荧光强度不同。选择培养18小时（对数中期）对FAX过表达突变体的相对荧光强度进行测定,CrFAX1-OX中的中性脂含量较野生型提高17%,CrFAX2-OX中的中性脂含量较野生型提高11%。采用重量法测定莱茵衣藻中总脂质含量,结果表明FAX基因过表达莱茵衣藻的总脂含量高于野生型,其中CrFAX1-OX中的总脂质含量较野生型提高24%,CrFAX2-OX中的总脂质含量较野生型提高18%。为了进一步说明转化藻中各脂肪酸成分的累积状况,通过对莱茵衣藻中的脂肪酸成分进行甲酯化后进行气相测定。结果表明棕榈酸（Palmitic acid,C16:0）、油酸（Oleic acid,C18:1）,α-亚麻酸（Alpha-linolenic acid,C18:3）等成分都较野生型有显著增长。有趣的是,FAX基因过表达莱茵衣藻的生物量较野生型减少,但是相同体积下,其叶绿素-a的含量却较野生型提高了29%和20%。说明FAX基因过表达莱茵衣藻的在提高脂质合成水平的同时也会刺激植物增加光合效率,为脂质合成不断的提供底物,此时藻细胞处于新陈代谢旺盛的状态。5.转录组分析CrFAX基因过表达莱茵衣藻的差异表达基因,其中的ACS已被证明参与脂肪酸的酰基化过程,从而参与TAG的合成,且该基因在在转化藻中表达量上调。对莱茵衣藻ACS进行荧光定量PCR验证,转化藻中ACS基因表达量显著高于野生型,从而证明FAX在莱茵衣藻中参与脂质合成过程。6.在酵母中验证莱茵衣藻FAX基因功能。将CrFAX基因转入酵母载体pYES2.0后转化进入酵母。将转化的酵母培养在由脂肪酸组成的液体培养基中,液体培养2个小时和培养4个小时后,离心收集酵母细胞。分别对表达CrFAX基因的酵母细胞和转入pYES2.0空载的酵母细胞内的脂肪酸组分进行测量,结果表明CrFAX能在酵母中参与脂肪酸运输,且主要运输的为C16:0、C18:0和C18:3等脂肪酸。7.在氮饥饿条件下,对FAX基因过表达莱茵衣藻的生长状况、油脂累积和叶绿素-a含量分析。在缺氮条件下,细胞数量也与OD680呈线性相关,并且相关系数R2=0.9761。并且与TAP培养基相比,缺氮条件下,莱茵衣藻的生长速率更低,到达平台期的细胞浓度更低。并且FAX基因过表达莱茵衣藻生长状况与野生型相差更大,并且单个细胞的油脂产量更高。在缺氮培养18小时后,利用尼罗红染色法,发现单个CrFAX1-OX细胞中的中性脂含量较野生型提高11%,单个CrFAX2-OX细胞中的中性脂含量较野生型提高14%,尤其是C16:4（4,7,10,13）和C18:3（9,12,15）所占脂肪酸比例提高,而C16:4（4,7,10,13）和C18:3（9,12,15）是膜脂MGDG的主要成分。并且缺氮条件下,与对数期相比,平台期莱茵衣藻细胞有更高的脂质产量并且误差更小,可能是由于氮饥饿培养后期的培养基营养元素匮乏,脂质含量更稳定。8.在外加碳源(3g L-1 CH3COONa、6g L-1 Glucose)条件下对FAX基因过表达莱茵衣藻进行脂质成分分析。与TAP培养条件相比,FAX基因过表达莱茵衣藻有更高的脂质产量。对数期中期,过表达突变体CrFAX1-OX中的油脂含量较野生型提高15%,过表达突变体CrFAX2-OX中的油脂含量较野生型提高19%,尤其是C16:4（4,7,10,13）所占脂肪酸比例提高,这可能是由于外加碳源为膜脂和TAG的合成都提供了大量的碳通量,提高膜脂和TAG的合成量,从而实现油脂含量的显著增长。并且外加碳源条件下,能显著提高转化藻的C16:0和C18:0含量,从而提高生产的生物柴油质量。综上所述,本次研究通过构建CrFAX基因过表达载体,运用玻璃珠方法转化莱茵衣藻后,筛选获得FAX基因过表达莱茵衣藻。在莱茵衣藻中和酵母中都对CrFAX基因的功能进行了验证,证明莱茵衣藻FAX基因参与脂肪酸的运输,并且主要转运C16:0、C18:0和C18:3,从而为TAG的合成过程提供底物。并且可以通过将基因工程和额外添加碳源两种方式相结合,通过这两种方式的共同作用来提高藻细胞中油脂产量,从而为工业化生产生物柴油提供技术支持。为后续利用基因工程方法,增加生物燃料生产量和提高具有经济效益的脂质衍生物的质量提供理论依据。