论文部分内容阅读
背景:2型糖尿病发病机制十分复杂,其中细菌、脂毒性扮演重要角色。脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,研究表明2型糖尿病人群由于肠道菌群失调、血脂异常等导致肠黏膜通透性受损使血浆脂多糖呈低水平增高。有关系统评价显示,正常人血中能检测到微量的脂多糖,介于0.39~6.60 ng/mL,与严重急性炎症状态下脂多糖增加数10倍~100倍不同,2型糖尿病患者脂多糖水平虽然较普通人群明显增高,但平均增加约66.4%,其绝对值呈低度增高水平,故称之为“代谢性内毒素血症(metabolic endotoxemia)”。以往研究多关注于脂多糖诱导的胰岛素抵抗作用。相关研究表明低度增高浓度的脂多糖可以与巨噬细胞等免疫细胞表面的特异性Toll样受体4即TLR4结合,刺激炎症因子释放干扰胰岛素信号通路诱导胰岛素抵抗。除胰岛素抵抗外,胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病发病的另一关键环节。已证实胰岛β细胞膜表面亦存在TLR4,且脂多糖可以通过TLR4与β细胞结合。先前研究表明虽然高浓度的脂多糖(1ug/mL)诱导胰岛β细胞损伤,然而代谢性内毒素血症浓度的脂多糖(1~数10 ng/mL)并不影响β细胞功能。由此,2型糖尿病等慢性代谢疾病中常见的低度增高的脂多糖对胰岛β细胞的影响并不明确。2型糖尿病人群中常存在增高的游离脂肪酸。与脂多糖类似,虽然其水平明显高于普通人群,但多呈低度增高,平均0.40~0.66 mmol/L。软脂酸(棕榈酸)约占游离脂肪酸的四分之一,是游离脂肪酸中与代谢疾病相关的重要组分。先前研究表明,高浓度棕榈酸(≥0.3 mmol/L)可以通过促进神经酰胺合成、内质网及氧化应激水平增高等,诱导β细胞细胞凋亡、抑制胰岛素的合成和分泌。然而也有研究发现,在糖代谢紊乱人群中更常见的低度增高浓度的棕榈酸(0.1~0.2 mmol/L)并不影响β细胞功能。低度增高浓度的棕榈酸和脂多糖在2型糖尿病人群中常广泛并存,相关研究表明低度增高的棕榈酸与脂多糖协同可以通过调节神经鞘脂信号分子代谢促进免疫细胞分泌炎症因子。由于胰岛β细胞膜上存在棕榈酸和脂多糖作用的共同受体TLR4,我们推测,低度增高的棕榈酸与脂多糖虽然单独并不引起β细胞损伤,两者协同可能产生类似作用于巨噬细胞的协同效应从而影响β细胞功能。此外,我们前期报道中性神经酰胺酶作为鞘脂代谢通路的关键酶在调控2型糖尿病胰岛β细胞损伤中扮演着重要角色,因此,我们进一步研究了中性神经酰胺酶在低度增高的棕榈酸与脂多糖协同影响β细胞功能中扮演的角色。综上,本研究首次观察了广泛存在于2型糖尿病人群的低度增高的棕榈酸与脂多糖协同损伤胰岛β细胞的作用,并探讨相关机制。目的:探讨低度增高的游离脂肪酸与脂多糖对胰岛β细胞的损伤及可能机制。方法:(1)体外培养大鼠胰岛β细胞株INS-1,待细胞贴壁后予以不同浓度的药物棕榈酸(0.1、0.125、0.2、0.25、0.3 mmol/L)干预24小时,CCK8法检测细胞活力。(2)予不同浓度的脂多糖(1、2、5、10、50 ng/mL)干预INS-1细胞24小时后CCK8法检测细胞活力,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以检测细胞凋亡。(3)采用0.125 mmol/L棕榈酸与不同浓度的脂多糖(1、5、10、50 ng/mL)联合刺激INS-1细胞24小时后,CCK8法检测细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡。筛选出后续实验所需棕榈酸、脂多糖浓度。(4)用0.125 mmol/L棕榈酸与10 ng/mL脂多糖联合刺激INS-1细胞24小时后,Western blot方法检测细胞内神经鞘脂代谢的关键酶-中性神经酰胺酶(NCDase)的蛋白表达水平。(5)建立过表达NCDase基因重组质粒pEGFP-C3-NCDase并转染INS-1细胞后,用0.125 mmol/L棕榈酸、10 ng/mL脂多糖联合刺激24小时,再通过CCK8方法检测INS-1细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡。结果:(1)棕榈酸在0.2~0.3 mmol/L浓度范围内,对INS-1细胞活力有明显的抑制作用(P<0.05),而在0.1、0.125 mmol/L浓度时对于INS-1细胞活力的影响无明显统计学意义。(2)脂多糖在浓度1、2、5、10、50 ng/mL时刺激INS-1细胞24小时,对细胞活力及凋亡的影响差异无统计学意义。(3)棕榈酸(0.125mmol/L)联合脂多糖(10 ng/mL、50ng/mL)作用于INS-1细胞24小时后可明显抑制其细胞活力、诱导细胞凋亡(P<0.05)。(4)0.125 mmol/L棕榈酸联合10ng/mL脂多糖可协同下调INS-1细胞内NCDase的蛋白表达水平(P<0.05)。(5)过表达NCDase减轻了棕榈酸协同脂多糖诱导INS-1细胞活性抑制及凋亡(P<0.05)。结论:低度增高的棕榈酸与脂多糖协同刺激可产生胰岛β细胞毒性作用,其机制可能与下调细胞内NCDase表达有关。