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血管紧张素转化酶（ACE）是肾素—血管紧张素—醛固酮系统（RAAS系统）中的一种关键酶,ACE能将血管紧张素I水解成血管紧张素II,同时释放缓激肽。二肽羧肽酶作为哺乳动物中一种重要的ACE,将血管紧张素I水解成血管紧张素II,并从C端有序的释放苯丙氨酸-精氨酸和丝氨酸-脯氨酸,但不切割酰胺键。本研究是在溶杆菌属（Lysobacter sp.）细菌基因组中发现两个与哺乳动物ACE类似的基因序列,以本室保藏的菌株Lysobacter sp.CW239为研究材料,对两个基因进行了分子克隆、异源表达和酶生物学研究。成功克隆了两个ACE基因（cp1,cp2）,在此基础上,通过原核表达技术获得高纯度的重组酶,并对两个ACE重组酶的生物学活性进行了研究。主要结果如下:1.在溶杆菌属模式菌种基因组分析过程中,发现两个类似ACE基因序列,设计特异性引物,以本研究室保存的Lysobacter sp.CW239基因组为DNA扩增模板,PCR扩增得到两个ACE类似基因（239cp1和239cp2）。其中,239cp1的全长为2175 bp,共编码724个氨基酸,蛋白分子量约为80.4 k Da,等电点为5.21;239cp2的全长为2202 bp,共编码733个氨基酸,蛋白分子量约为80.5 k Da,等电点为5.23。采用Signal P4.1程序对两个ACE蛋白序列进行N端信号肽预测,结果显示在231cp1和239cp2中均未发现信号肽,说明231cp1和239cp2所表达的蛋白无跨膜结构。通过Blast比对分析,选取其它物种中代表性的6个ACE蛋白序列,采用CLUSTAL＿X和Bio Edit软件进行多重位点分析,结果显示本研究克隆得到的两个ACE类似酶,均具有典型ACE蛋白所具备的三个保守区域,并且在第二个保守区域中,所推定的催化位点也与其他典型的ACE一致,含有两个锌结合残基和一个必需的谷氨酸残基。因此,本研究从细菌中克隆得到的两个ACE类似序列,从蛋白结构上完全符合ACE结构特征。2.将239cp1和239cp2分别连接到原核表达载体PET-32a（+）中,然后再转入异源表达宿主E.coli BL21（DE3）中。结果发现,239cp1在28℃和IPTG浓度为0.2 mmol/L诱导表达4 h后,菌体破碎的上清中可以获得大量的可溶性目标蛋白,重组蛋白质（带标签）分子约为97 k Da。239cp2在16℃和IPTG浓度为0.2mmol/L诱导表达4 h后,诱导表达后菌体破碎上清中有大量的可溶性目标蛋白,重组蛋白质（带标签）分子量约为97 k Da。采用标准ACE检测方法对2个重组蛋白进行酶活验证,发现两个融合蛋白均具有ACE生物活性。酶解产物通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析发现,两个ACE重组酶均可以将血管紧张素I的替代底物马尿酰-组氨酸-亮氨酸（HHL）水解成马尿酸（HA）和组氨酸-亮氨酸,因此两个重组酶均具有ACE生物活性。3.最适反应条件研究结果显示:239cp1的最适温度为37℃,最适p H为7.0。239cp2的最适温度为30℃,最适p H为6.0。两个重组酶在4℃条件下保存,温度稳定性较好;在p H 5.0-9.0的缓冲体系中,p H的耐受性较好;Na+对ACE酶活反应有明显的抑制作用,K+对酶活有明显的促进作用;在Na Cl溶液浓度为1 M时,两个ACE的盐离子稳定性良好;0.1 M Cu2+、1 M Cu2+、0.1 M Zn2+和1 M Zn2+对两个ACE的酶活有显著抑制作用。4.对本研究中的ACE以及兔子肺部中的ACE（A6778）标准品的酶动力学常数研究发现,239cp1的米氏常数（Km）值为6.385 m M,最大反应速率（Vmax）为525.125μmol·min-1·mg-1,催化常数（Kcat）值为703.67 s-1,Kcat/Km为110.203s-1·m M-1。239cp2的Km值为6.413 m M,Vmax为381.375μmol·min-1·mg-1,Kcat值为511.68 s-1,Kcat/Km为79.788 s-1·m M-1。ACE（A6778）的Km值为3.149 m M,Vmax为63.2μmol·min-1·mg-1,Kcat值为147.47 s-1,Kcat/Km为46.83 s-1·m M-1。从三者的Km值分析得知,239cp1、239cp2和ACE（A6778）的Km值差异不明显,说明三个ACE和底物亲和力差异不明显。由Kcat/Km的结果得知,三者差异较大,其中239cp1的Kcat/Km值最大,说明239cp1对底物的催化效率最高、专一性最好,也就是239cp1的体外活性最好。5.不同金属离子对两个ACE的动力学特征影响的结果显示,由催化常数（Kcat）分析得知,除1 M Ca2+以外,其他金属离子的添加都能够大幅增大239cp1的Kcat。从米氏常数（Km）分析发现,各金属离子的添加都将增大239cp1的Km。综合Kcat/Km分析,239cp1的Kcat/Km在添加金属离子之后都有所降低,金属离子的添加会降低239cp1的整体催化效率。同样,所有金属离子的添加都能够大幅增大239cp2的Kcat值,其中1 M Ca2+的添加对239cp2的Kcat值增加量最大。从米氏常数（Km）分析得知,各金属离子的添加都将增大239cp2的Km。综合Kcat/Km分析,239cp2的Kcat/Km比值在添加了金属离子之后都降低了,因此金属离子的添加降低了239cp2的整体催化效率。