水蛭素是目前已知的自然界中最强的抗凝血因子。水蛭素与凝血酶亲和力极高，以摩尔比1:1结合形成非共价复合物。然而水蛭素与凝血酶不可逆结合后导致出血、在体内代谢需依赖肾功能及缺少有效的解毒剂，这些缺陷限制了其广泛应用。一种新型水蛭素类似物-比伐卢定，与凝血酶结合后，会逐渐被凝血酶逆转。凝血酶可以从比伐卢定精氨酸的羧基端进行特异性酶切，该位置被切断后，凝血酶活性中心重新暴露，纤维蛋白原与残余的比伐卢定竞争性地结合凝血酶，生成新的纤维蛋白，从而达到可逆转的目的，减小临床应用时的出血风险；而且比伐卢定主要依靠酶降解，大大减轻了患者的肾负担。本研究设计了将水蛭素HV1中间片段，通过计算机模拟，替换成比伐卢定可被凝血酶酶切的序列构建具有可逆转的水蛭素类似物。研究目的：基于水蛭素和比伐卢定的优点，本课题通过三维结构模拟计算，筛选出理论最佳结构，采用毕赤酵母表达系统表达，期获得一种可被凝血酶所逆转的重组可逆转水蛭素（rRH）。研究方法：⑴通过对水蛭素HV1型的计算机三维结构模拟及能量计算，得出理论最佳结构，并命名为rRH。⑵rRH在毕赤酵母中表达。全基因合成rRH cDNA序列，经Xho I和Not I双酶切先转入质粒pPIC9中，再经Sal I和Sac I转入质粒pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-rRH。将构建的重组质粒pPIC9K-rRH线性化后，电转入感受态毕赤酵母菌株GS115。⑶利用Geneticin（G418）进行拷贝筛选，同时用MD和MM固体平板鉴定表型。⑷摇床培养表达筛选稳定高表达菌株，并进行30L发酵培养。⑸发酵上清液经Phenyl F.F柱和反相C18柱进行纯化，并将获得的蛋白进行质谱分子量和质量肽图分析。⑹利用纤维蛋白原直接滴定法和生色底物法测定rRH的抗凝血酶活性⑺利用反相HPLC法和生色底物法测定rRH与凝血酶结合动力学，以确定rRH的可逆转性。研究结果：⑴经酶切鉴定，成功构建重组质粒pPIC9K-rRH，并电转入毕赤酵母菌株GS115中。⑵MD和MM固体平板鉴定毕赤酵母重组转化子均匀Mut+。⑶将摇床及发酵罐表达的样品进行纯化回收，结果表明，成功表达重组蛋白rRH，纯度达到98%以上。质谱分子量和质量肽图与理论一致。⑷纤维蛋白原和生色底物法结果表明rRH的抗凝血酶活性约为14000ATU。⑸rRH与凝血酶给动力学结果表明，rRH的可逆转性为20-40%。