猪圆环病毒3型分子流行病学调查及TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

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猪圆环病毒3型(Porcine Circovirus Type 3,PCV3)属于圆环病毒科(Circovirus),圆环病毒属(Circovirus),可引起猪繁殖障碍、皮炎肾病综合征及心脏多系统炎症等疾病。2015年,美国堪萨斯州立大学Palinski等从北卡罗来纳州的一个爆发PDNS(皮炎和肾病综合征)的猪场中检测到了一种新型猪圆环病毒,并且通过宏基因组测序和遗传进化分析将其命名为猪圆环病毒3型。PCV3基因组长约2.0kb,共分为PCV3a和PCV3b两个基因亚群,主要有三个开放型阅读框:ORF1、ORF2和ORF3,其中ORF1与ORF2分别编码病毒复制酶蛋白(Rep)与衣壳蛋白(Cap蛋白)。遗传进化分析表明,PCV3与PCV1、PCV2、犬圆环病毒及蝙蝠圆环病毒属于同一进化分支。目前,PCV3在我国部分省市时有报道,因此,PCV3在我国的流行情况、遗传变异情况等均仍有待研究。本研究根据猪圆环病毒3型PCV3-Hebei-LY_2015毒株(Genebank登录号:MF318451.1)设计了特异性鉴定引物,建立了PCV3常规PCR的检测方法,结果显示该方法特异性高,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均无交叉反应,且该方法具有良好的重复性,用3份阳性病料提取的DNA分别重复3次扩增,共扩增9次,结果均为阳性,表明该方法可应用于PCV3的临床检测和诊断。利用该方法对来自河南、陕西、江西、广西、四川、重庆等15个省市的64家大型猪场的454份疑似感染病料进行流行病学调查。结果显示:在9个省市的样品中检测到PCV3,样本阳性率为31.7%,猪场阳性率为28.1%,其中养猪大省四川、广东、河南等检出率均高于35%,从PCV3的流行分布来看,主要集中在我国中西部、中东部以及华南地区。另外,在猪只的组织器官中均可检测到PCV3的存在,其中心脏、肺脏、肾脏、脑组织中PCV3阳性率均超过30%,因此说明PCV3能够在猪只身体的各个器官中进行增殖。本研究对来自不同省市的16份阳性病料的Cap基因进行测序,并与国内外各圆环病毒的Cap基因进行分子遗传进化分析及其Cap蛋白氨基酸分析。结果显示,16株PCV3的Cap基因之间的同源性为98.0%~100%,分别与国内其它PCV3的Cap蛋白基因同源性为97.6%~99.8%,与国外PCV3的Cap基因序列同源性为97.5%~99.8%;与鸭圆环病毒的Cap基因同源性为38.1%~38.3%,与PCV1的Cap基因同源性为32.8%~33.5%,与PCV2的Cap基因同源性为31.4%~32.1%,与蝙蝠圆环病毒的Cap基因同源性为40.7%~41.5%,表明PCV3和蝙蝠圆环病毒具有更近的亲缘关系。分子遗传进化分析结果显示,16株PCV3中15株属于PCV3a1,1株属于PCV3b,表明我国PCV3主要以PCV3a1为主,并伴随有PCV3a2和PCV3b,与国内外的流行情况基本一致。氨基酸序列分析结果表明,PCV3的Cap基因氨基酸位点突变主要在9~28、45~66、139~144点位。本研究根据猪圆环病毒3型PCV3-Hebei-LY_2015毒株(Genebank登录号:MF318451.1)设计了特异性引物和探针,建立了PCV3Taq Man荧光定量PCR检测方法。实验结果证明该方法灵敏度高,特异性好,与CSFV、PRRSV、PCV2、PRV等均无交叉反应。经临床阳性病料检测结果表明该方法具有良好的敏感性,可用于PCV3的临床检测及其发病标准指标评估。通过本次研究掌握了PCV3在我国的感染流行情况,遗传变异情况,从而为预防和控制我国PCV3的流行和蔓延打下了坚实的理论基础,同时通过建立Taq Man荧光定量PCR检测方法可以为下一步PCV3疫苗开发及发病机制等研究提供可靠工具。
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