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芽孢杆菌属中的一些成员能产生大量的生物活性分子,可以抑制病原菌的生长。枯草芽孢杆菌,作为普遍使用和充分研究的生物之一,其基因组中有4-5%用于合成抗菌物质,可以产生二十多种结构不同的抗菌化合物。其中,环状脂肽surfactin具有强大的生物表面活性,同时具有抗细菌、抗肿瘤、抗病毒、抗支原体和防止纤维蛋白凝块等生物活性。因此,研究人员对surfactin的兴趣日趋增加,希望通过对surfactin等脂肽的改造获得更具潜力的活性物质。Surfactin通过非核糖体多肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetases, NRPS)催化而得,合成酶中模块的顺序和类型决定了产物中氨基酸的顺序。因此,通过对合成酶的修饰可以实现对产物的改造。在合成过程中,还涉及到一个功能酶Sfp(由sfp基因编码),在Sfp缺失的情况下将不能产生surfactin。故对surfactin合成酶的改造分析,不仅包括对surfactin合成酶基因的改造分析,还包括sfp基因的改造分析。本论文主要对Bacillus subtilis fmbj中surfactin合成酶基因内编码SrfAC-A结构域的基因进行克隆表达,并对其进行定点突变；将外源sfp基因整合入Bacillus subtilis168中,使其产surfactin。主要结果分述如下：1.从枯草芽孢杆菌fmbj寺扩增出FsrfAC-A基因,在大肠杆菌表达系统中表达,并对其活性进行了测定。根据NCBI上B.subtilis168菌株的srfAC-A基因序列,设计引物,用PCR的方法从枯草芽孢杆菌fmbj中克隆出srfAC-A基因,命名为FsrfAC-A。用酶切和酶连的方法将FsrfAC-A基因与表达质粒pET23a相连,并在大肠杆菌表达系统中进行表达。用Ni2+柱对重组蛋白FSrfAC-A进行分离纯化后,用非放射性的方法测定其活性。测定结果发现,FSrfAC-A对Leu和Ile有选择活性,且对Ile的活性更高。2.对FsrfAC-A基因进行了定点突变,将突变体在大肠杆菌表达系统中表达,并构建了突变基因重组整合质粒(用于枯草芽孢杆菌系统)。用重叠延伸PCR的方法将克隆所得的FsrfAC-A基因进行突变,使FSrfAC-A结构域的278位由苯丙氨酸变为苏氨酸,322位由半胱氨酸变为丙氨酸,331位由苯丙氨酸变为半胱氨酸。将突变后基因分别连于pET23a和pET32a,并在大肠杆菌中表达,发现都为非可溶性表达。将突变后基因与枯草芽孢杆菌整合质粒pE5916相连得到重组整合质粒,但因fmbj野生菌株的感受态制备不易,使后续实验不能进行。3.用同源重组的方法将外源sfp基因整合入枯草芽孢杆菌168菌株中,将其改造为产surfactin的菌株。通过分析多株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的sfp基因,从基因的上下游找出较为保守的区域,设计引物,从实验室保存的枯草芽孢杆菌Nja-9中扩增出sfp基因。将获得的sfp基因与P43启动子和终止子相连,构建了sfp基因表达框,并连于枯草芽孢杆菌整合质粒pDG1730上,利用pDG1730本身的淀粉酶E基因与B. subtilis168菌株的基因组DNA进行整合,获得了产surfactin的重组菌株B. subtilis121.