15-LO在HPH中的作用及机制研究

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第一部分:H0-1在15-L0调控的缺氧性肺动脉高压中的作用及机制研究  目的:缺氧诱导肺小动脉15-脂氧酶(15-LO)的表达,催化花生四烯酸(AA)生成15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE),15-HETE具有调控细胞分化、增殖、凋亡的功能,与肺动脉高压密切相关,但缺氧如何调控15-LO的机制尚不清楚。而血红素加氧酶-1(HO-1)是一种应激反应蛋白,缺氧可上调其表达。缺氧是否通过HO-1途径调控15-LO的表达值得注意。因此本研究旨在确定HO-1在15-LO调控的缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary arterial hyperteasion,HPH)中的作用及机制。  方法:1.通过对转基因小鼠右心室收缩压(Right Vemricular Systolic Pressures,RVSP)以及组织浴漕血管张力测定试验确定HO-1在缺氧性肺动脉血管收缩(Hypoxic pulmonary arterial vasoconstriction,HPV)中的作用,采用苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色法明确HO-1在缺氧性肺血管重构(Hypoxicpulmonary arterial vessel remodeling-HPVR)中的作用。2.通过对转基因小鼠肺组织进行免疫组织化学和原位杂交技术,确定HO-1对15-LO组织分布和细胞定位的影响。3.Western-Blot及RT-PCR技术确定缺氧通过HO-1对15-LO蛋白及mRNA表达的影响。4.利用高效液相色谱法(High-Pressure LiquidChromatography,HPLC)对转基因鼠肺组织及各药物处理细胞模型进行测定,确定HO-1对15-LO代谢产物15-HETE的影响。5.采用免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation,CoIP)及激光共聚焦扫描技术确定缺氧条件下HO-1与15-LO同工酶之间的蛋白结合及细胞定位。  结果:1.HO-1过表达转基因小鼠肺血管对血管收缩剂的反应性明显增强,且管壁增厚。2.HO-1能够上调肺组织中15-LO的表达,HO-1激动剂上调肺动脉平滑肌细胞15-LO的表达,并且诱导内源性15-HETE的生成。3.缺氧时HO-1激动剂上调肺动脉平滑肌细胞15-LO的表达,并且诱导内源性15-HETE的生成,而加入抑制剂及干扰等处理因素阻断HO-1后,15-LO表达下调,并减少内源性15-HETE的生成。4.HO-1通过与15-LO同工酶直接结合而对其进行调控,且在缺氧条件下HO-1与15-LO具有细胞共分布及定位。  结论:缺氧通过HO-1上调15-LO及15-HETE的表达引起肺动脉血管收缩以及血管重构。  第二部分:15-羟基二十碳四烯酸抑制肺动脉平滑肌细胞凋亡的机制研究  目的:15-HETE具有调控细胞分化、增殖、凋亡的功能,与肺动脉高压密切相关,但15-HETE保护肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth musle cells,PASMCs)凋亡的机制尚不清楚。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor1a,HIF-1a)是一种应急蛋白,它可通过调控诱导型一氧化氮合酶(Inducible NitricOxide Synthase,iNOS)等表达在缺氧应激反应中起重要作用。因此本研究旨在确定15-脂氧酶/15-羟二十碳四烯酸(15-LO/15-HETE)是通过HIF-1a及iNOS信号途径抑制肺动脉平滑肌细胞凋亡参与缺氧性肺动脉高压(Hypoxicpulmonary arterial hypertension,HPH)的发生。  方法:1.培养大鼠的肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth musclecells,PASMCs),通过Western blot和RT-PCR技术确定缺氧不同时间对HIF-1a、iNOS表达的影响。2.通过NDGA和SiRNA技术阻断内源性15-LO/15-HETE的产生后,观察缺氧对PASMC中HIF-1a、iNOS蛋白及mRNA表达的影响。3.确定外源性15-HETE对PASMC中HIF-1a、iNOS表达的影响。4.通过MTT细胞活力测定实验,应用YC-1、SMT、L-canavanine以及SiRNA分别阻断HIF-1a、iNOS后,观察15-HETE对细胞活力的影响。5.通过Caspasc-3活力测定、吖啶橙染色法(AO)、Tunel染色法、线粒体膜电位测定等技术观察阻断HIF-1a、iNOS后,15-HETE对凋亡形态学的影响。  结果:1.PASMCs暴露缺氧24小时后,HIF-1a、iNOS的蛋白以及mRNA表达量明显上调;PASMCs暴露缺氧48小时后,iNOS的蛋白以及mRNA表达上调最为明显。2.阻断内源性15-HETE产生后,缺氧对iNOS表达的上调作用明显减弱;阻断HIF-1a后,缺氧对iNOS表达的上调作用明显减弱。3.阻断iNOS后能够明显缓解15-HETE、缺氧对PASMC凋亡的抑制作用;而阻断HIF-1a后,继续阻断iNOS能够进一步缓解缺氧对PASMC凋亡的抑制作用。4.阻断iNOS后,15-HETE对胞核皱缩、TUNEL阳性细胞数、线粒体膜电位除极化的抑制作用明显降低;阻断HIF-1a后,继续阻断iNOS能够缓解缺氧对细胞凋亡形态的影响。  结论:15-HETE通过激活iNOS信号通路抑制PASMC凋亡,HIF-1a参与iNOS信号通路的激活,进而调控了缺氧肺动脉血管收缩(Hypoxic pulmonaryarterial vasoconstriction,HPV)和缺氧性肺血管重构(Hypoxic pulmonary arterialvessel remodeling,HPVR),从而参与HPH的发生。
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