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背景目前我们已知Apelin-13参与了许多血管性疾病的形成,如肿瘤、脑缺血、妇科疾病、阿尔茨海默症等神经性病变等。目前对Apelin-13的研究主要集中在Apelin/APJ信号系统及信号分子(TGF-beta、FGF、VEGF、HIF和PDGF等)的相互关系上。但是血管的发生和发展是一个多基因共同调节的生理过程,除了 Apelin/APJ信号途径以外,Apelin-13还调节了哪些生理过程、血管生成相关因子和信号通路,仍需要更多的了解。目的本研究以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,通过分析Apelin-13对HUVECs增殖、迁移、凋亡的作用及对其Affimetrix表达谱中此功能相关基因和通路的研究,探究Apelin-13促进血管生成的基因组学机制,为进一步研究提供了更直观、准确的方法和更丰富的材料。方法1.HUVECs的离体培养和形态检验:使用含10%FBS的DMEM培养基在二氧化碳培养箱中培养,期间需经常在倒置荧光显微镜下观察细胞的培养条件和生长状况。生长状态良好的细胞可用于后续指标的检测。2.实时定量分析系统(real time cells analysis,RTCA)检测Apelin-13加入后细胞的生长和迁移情况:将HUVECs在E-Plate16增殖板中每孔加入3.5x104个细胞,迁移板中每孔加入4.0×104个细胞。细胞进行饥饿处理3h,以梯度浓度Apelin-13(O.O1nM、1nM、100nM)刺激的实验组和不加Apelin-13刺激的对照组一同置于系统中,之后检测细胞的增殖和迁移曲线。3.流式细胞术检测Apelin-13对凋亡细胞的影响:内皮细胞饥饿3h后,分为实验组(Apelin-13和H202共刺激组)和对照组(H2O2单刺激组),刺激时间均为12h。之后用FITC、PI染料标记不同状态细胞,流式细胞仪上机测定荧光的变化。4.Affimetrix的表达谱芯片检测Apelin-13刺激与未刺激的HUVECs基因表达谱的差异:取生长状态一致的两板HUVECs,分为100nM浓度Apelin-13刺激组和对照组。实验组经Apelin-13刺激12h后,和对照组一起提取总RNA,然后逆转录成双链cDNA。洗脱和染色后利用Affymetrix Scanner 3000扫描得到原始图像。对表达差异≥3或≤-1的mRNA基因进行归类分析。分析差异基因的GO和KEGG通路富集的显著性,并用统计学方法计算,找出富集度最高的生化过程、细胞组成和分子功能分布。5.用逆转录 PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot的方法检测Affymetrix表达谱芯片筛选出的基因不具有假阳性。使用与芯片相同生长状态的细胞,同样用不同浓度(0.01nM、1nM、100nM)Apelin-13刺激细胞12h,与未刺激细胞一起提取mRNA,逆转录成DNA正义链之后进行PCR反应,以beta-actin为内部参考物。将相关反应条带和beta-actin密度之比作为选出基因mRNA含量的标准。提取目的蛋白,用免疫印迹的方法进一步验证差异基因在蛋白水平上也具有表达差异。取相同生长状态的细胞,同样用O.O1nM、1nM和100nM浓度Apelin-13刺激细胞12h,之后将提取出的蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,将蛋白条带以非共价键结合到聚偏二氟乙烯(Poly vinylidene fluoride,PVDF)膜上。膜用鼠单克隆抗体(OSBPL8和BMPR2)和家兔的beta-actin抗体4℃分别孵育一夜。然后在IgG二抗中室温条件下孵育,山羊抗鼠和抗兔的IgG结合物中含有相关过氧化物酶。OSBPL8和BMPR2蛋白产物的相对含量以它们与beta-actin灰度的比值来表示。最后进行分析统计处理。结果1.显微镜观察得到:多边形、铺路石状、生长均匀的人脐静脉内皮细胞。2.使用实时定量分析系统检测Apelin-13加入后细胞的生长和迁移情况。结果表明,Apelin-13可刺激细胞的增殖和迁移,且这种刺激作用具有浓度依赖性,在Apelin-13浓度为100nM时达到最大值。3.使用流式细胞仪来检测Apelin-13刺激后细胞凋亡率的变化。结果显示与H202单刺激的细胞相比,用Apelin-13和H202共刺激的细胞早期和晚期凋亡的细胞群均变稀少,活细胞比例大幅度增加。4.Affimetrix的表达谱芯片GO分析结果表明,显著差异的生化过程中,与细胞周期和细胞凋亡相关基因富集度较高。KEGG通路富集分析结果表明,与细胞周期相关的通路和与泛素介导的蛋白降解途径相关的基因通路富集度也均在差异表达通路的前十位。挑选差异表达倍数大,与增殖、迁移和凋亡功能有关且位于关键通路的基因作为进一步研究的对象。5.RT-PCR和Western blot验证目的基因不具有假阳性。结果显示,Apelin-13能上调 STAG2、ITGAV、RICTOR、NEDD4、BMPR2 基因 mRNA 的表达及 BMPR2 蛋白的表达,下调OSBPL8基因mRNA和蛋白的表达。这与Affimetrix的表达谱芯片结果相一致。结论Apelin-13能够提高HUVECs的增殖和迁移速率,抑制细胞的凋亡进程。离体培养的内皮细胞用Apelin-13刺激后,在基因表达谱中可得到大量差异表达的基因。通过GO和KEGG对差异基因进行富集性分析后发现,差异表达的基因多与细胞周期的调控、细胞的凋亡、血管的发生和发展、肿瘤中的发展和转移等功能密切相关。挑选出与这些高富集的生化过程、细胞组分和信号通路相关的基因如STAG2、ITGAV、BMPR2和OSBPL8等作为进一步研究对象,用RT-PCR和Western blot验证基因芯片对这些基因的检测结果。结果表明Apelin-13对这些基因的表达量确实产生了较大的影响。Apelin-13有可能通过这些信号因子,调控HUVECs的细胞周期,提高其增殖和迁移速率,抑制细胞的凋亡进程,从而参与血管生成过程的调节。本研究为更深一步探讨Apelin-13发挥作用可能的机理给出了大量的数据支持,对推进病理下血管治疗的研究提供了新的思路,具有重要意义。