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目的:心肌缺血/再灌注损伤(myocardialischemic/reperfusioninjury，MI/RI)是指心肌组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，组织的损伤程度不仅没有减轻反而较缺血时进一步加重、器官功能进一步恶化的综合征。局部和全身的炎症反应为心肌缺血/再灌注损伤的特征，进一步可能发展为组织损伤并严重影响左心室功能。越来越多的实验研究证明心肌缺血/再灌注是一组慢性炎症疾病。近年来发现Toll样受体在炎症反应中的作用越来越重要，与缺血/再灌注损伤的关系越来越紧密。本实验旨在通过观察大鼠心肌组织缺血/再灌注急性期Toll样受体2(Toll-likereceptor2，TLR2)和4(Toll-likereceptor4，TLR4)及相关炎性因子mRNA及蛋白质的表达，探讨TLR2和TLR4的相互关系及各自在心肌缺血/再灌注损伤中的作用。
方法:选择体重相似的雄性Wistar大鼠42只，根据再灌注时间不同分为7组（再灌注1、2、4、6、12、24h和7d组），每组6只。用戊巴比妥钠麻醉大鼠后固定于鼠台，在呼吸机辅助呼吸的前提下，开胸挤出心脏，结扎前降支主干，建立大鼠心肌缺血模型，缺血1h后，再次开胸，在胸腔内用显微外科剪剪开结扎线，建立再灌注模型，再灌注达到预期时间后，再次麻醉大鼠，固定于鼠台上，分离颈部皮肤及皮下组织，露出气管并进行气管插管，然后分离出右侧颈总动脉并插管备用。开胸分离出心脏，原位结扎前降支。从颈总动脉注入约1～1.5mL酞菁蓝溶液，可见到心脏部分变蓝，立即剪下心脏，用冰盐水冲洗干净后放于干净培养皿内，置于冰箱内约8min后取出，将心脏切为约2mm的切片，随后进行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色，染色结束后用扫描仪扫描图像并保存，用图像分析软件分析缺血面积及梗死面积，并根据结果计算缺血范围及梗死范围。
再选择同样体重范围的雄性Wistar大鼠84只，随机分为缺血/再灌注组（I/R组）和假手术组(sham组)，每组42只，I/R组及sham组再按不同再灌注时间点(1、2、4、6、12、24h和7d)随机分为7组，每组6只。再灌注模型建立后，在达到预定时间点后开胸分离出心脏，从主动脉弓水平剪下心脏，用冰生理盐水冲洗干净后置于干净培养皿中，于冰箱预冷约8min，取出后弃去心尖部及心底部，将心脏切成厚度约2mm的心肌切片，其中一片放入包埋框进行石蜡包埋后切片染色，染色包括HE染色和免疫组化染色。另外的心肌切片去除右室后，按缺血梗死区及室间隔分别装入不同的冻存管内，置于液氮中1h后存于冰箱中，待以后研磨提取RNA及PCR。实时定量聚合酶链式反应(realtime-polymerasechainreaction，RT-PCR)定量检测心肌组织TLR2及TLR4mRNA水平。逆转录聚合酶链式反应(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，rt-PCR)测定心肌白介素-6(IL-6)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的mRNA水平。免疫组化检测心肌TLR2、TLR4及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达情况。
结果:(1)心肌组织酞菁蓝及TTC双染结果:随着再灌注时间的延长，缺血范围(risksize，RS)无明显统计学差异，而心肌梗死范围(infarctsize，IS)逐渐增大，在再灌注2h时达峰值后一直稳定在平台期，再灌注7d时左心室游离壁显著变薄，室间隔明显增厚，心室已发生重构。
(2)HE染色结果:在再灌注早期，sham组心肌组织形态未见明显改变，而I/R组心肌结构均有不同程度损伤，虽然心肌组织恢复了血供，但是心肌损伤并没有改善，而损伤仍在继续。在复灌7d时可见心室重塑，左室壁厚度明显变薄，大量成纤维细胞替代原有的心肌细胞。
(3)免疫组化结果:与sham组相比，TLR2和TLR4的蛋白水平均有升高，到再灌注4h时达高峰，随后逐渐下降，至第7d时有再次升高趋势，但与24h组比较差异无统计学意义。TNF-α蛋白从缺血/再灌注1h起就有升高，在再灌注6h达高峰之后有小幅度下降。TLR2及TLR4蛋白水平正相关，相关系数r=0.935，P＜0.01，TLR4蛋白与TNF-α蛋白表达量也成正相关，相关系数为r=0.818(P＜0.05)，而TLR2与TNF-α蛋白表达量无相关。
(4)RT-PCR结果:sham组和I/RR组TLR2、TLR4mRNA水平均出现不同程度上升，其中TLR4在再灌注4h时达高峰(vs.sham组，2.71±0.30，P＜0.01)，随后逐渐下降，至再灌注7d时TLR4水平有再次回升趋势。TLR2也在再灌注4小时到高峰(vs.sham组，3.95±0.58，P＜0.01)，之后逐渐下降。至第7天时未见上升趋势。TLR2mRNA的表达量与TLR4mRNA的表达量成正相关，相关系数r=0.844，P＜0.01。
(5)rt-PCR结果:IL-6在4h达到高峰(3.36±0.41，P＜0.01)后开始下降，到24h时基本降至正常水平，在再灌注7d时未见明显上升。MCP-1在缺血/再灌注后一直保持与sham组相当水平，在再灌注7d时才有明显升高(1.97±0.51，P＜0.01)。TLR2及TLR4mRNA的表达量均与IL-6mRNA的表达量成正相关，相关系数分别为r=0.813(P＜0.01)，r=0.791(P＜0.01)。
(6)TLRs与梗死范围相关关系:除去再灌注1h的时间点，24h内TLR2mRNA及TLR4mRNA与梗死范围均正相关，相关系数分别为r=0.936(P＜0.05),r=0.907(P＜0.05)。
结论:在心肌缺血/再灌注早期，心肌组织中TLR2和TLR4基因及蛋白水平迅速上调，早期促进下游炎症因子IL-6和TNF-α的产生造成心肌结构的损伤。在再灌注后期，TLR2和TLR4的再次升高可能使得晚期炎症因子MCP-1的表达增加，从而损伤心肌结构及功能，导致心肌重塑。TLR2与TLR4之间存在相关性，说明可能两种TLRs之间存在某种相互联系，互相促进各自的表达，在炎症过程中作为一个相互作用的整体而发挥效力。