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在全球环境气候变化剧烈的现代社会,新能源越来越受到人们的关注,氢能又是新能源中最具有发展前景的能源之一。生物制氢是一种清洁、环保的制氢方法。氢酶催化氢的代谢,其在生物制氢及氢能利用等方面有重要应用前景。然而氢酶不稳定、容易失活的特性,成为限制氢酶应用的主要问题。特殊生境的微生物由于其生存条件的特殊性,可能进化出具有特殊性能的氢酶。深海嗜热菌C.azorensis H53214是一株来自印度洋深海热泉口的细菌,经基因组序列分析表明,该菌株含有三个细胞周质[FeFe]-氢酶结构基因HydA1、HydA2、HydA3 和[FeFe]-氢酶成熟基因 HydE、HydF、HydG。与 Clostridium papyrooolvens及Chlamydomnas reinhardtii的[FeFe]-氢酶相比,HydA11,HydA2和HydA3的氨基酸序列同源性(ASH)分别为56%、66%、51%以及44%、43%、37%,表明该菌株[FeFe]-氢酶的氨基酸序列不同于已知的的其他[FeFe]-氢酶,是一类新颖的[FeFe]-氢酶。K.oxytocaHP1是一株从70℃温泉中分离得到的高产氢活性菌株,该菌株属于肠杆菌科,含有与大肠杆菌氢酶3相似的[NiFe]-氢酶,其培养条件简单,生长周期短,菌体产量高,适合大规模发酵培养。本论文克隆了C.azorensis H53214 的 HydA1、HydA2、HydE、HydF、HydG 基因,并亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,然后分别转入K.oxytoca HP1构建了重组菌株HP1-HydA1、HP1-HydA2、HP1-HydE、HP1-HydF 及 HP1-HydG。经 IPTG 诱导表达及厌氧孵育后转入葡萄糖产氢培养基进行产氢测试。结果表明HP1-HydA2在12 h内利用葡萄糖的产氢活性较对照HP1提高了 116.9%。但HP1-HydAl在12 h内利用葡萄糖的产氢活性仅为对照HP1的21.6%。IPTG诱导时长为3 h时,HP1-HydA2的氢酶相对酶活为对照的166.7%。温度为60℃时,HP1-HydA2的氢酶相对酶活最高。用亲和层析的方法对各重组菌株表达的蛋白进行纯化,测得HP1-HydAl菌液纯化 GST-HydA1[蛋白 7.3 mg/L;HP1-HydA2 菌液纯化 GST-HydA2 蛋白 11.2 mg/L;HP1-HydE 菌液纯化 GST-HydE 蛋白 14.9mg/L;HP1-HydF 菌液纯化 GST-HydF 蛋白 11 mg/L;HP1-HydG 菌液纯化 GST-HydG 蛋白 13.5 mg/L。