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背景:
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factot,VEGF),也称血管调理素(Vascutotropin)和血管通透因子(vascular permealility factor,VPF),是Ferrara等在1989年从牛垂体滤泡星状细胞的条件培养基中纯化出来的一种具有肝素结合活性的生长因子,是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异性的有丝分裂原,能特异性地作用于血管内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖[1],加速新生血管形成并增加血管通透性[2]。促进内皮细胞间质的胶原酶表达,促进血浆纤维蛋白原的外渗,导致纤维蛋白原的沉积。VEGF已应用于治疗缺血性疾病,如修改人体神经干细胞基因充分表达VEGF治疗大脑内出血中风[3],并且移植脂肪源性干细胞促进VEGF合成促进脑缺血疾病的血管再通[4]。VEGF在临床的应用有着更广阔的前景。
目的:
1.构建携带VEGF基因AdEasy复制缺陷型重组腺病毒载体系统。
2.大鼠骨髓间质干细胞的培养。
3.观察rAd-VEGF转染大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)后VEGF的表达情况。
方法:
1.从PCR2.1-VEGF质粒中克隆出VEGFA基因的编码序列。
2.VEGFA基因插入腺病毒系统的穿梭载体pAdTrack—CMV中。
3.在含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组获得重组子pAdeasy-1-VEGF。
4.鉴定pAdeasy-1-VEGF,将pAdeasy-1-VEGF转染人胚肾细胞(Ad293A细胞),获得含VEGF基因的重组腺病毒(rAd—VEGF),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。
5.反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50％组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度。
6.体外培养大鼠骨髓间质干细胞。
7.rAd—VEGF转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察并采用ELISA法检测VEGF的表达水平。
结果:
1.经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建出含有VEGF基因的腺病毒载体rAd—VEGF。
2.扩增得到1010PFU／ml高滴度重组腺病毒。
3.rAd—VEGFA转染骨髓基质细胞后,ELISA检测发现转染组上清液中VEGF蛋白分泌量明显高于对照组(P<0.01)。
结论:
成功构建含有VEGF基因的腺病毒载体rAd—VEGF,rAd-VEGF转染骨髓基质细胞能够表达并分泌VEGF,为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基础。