论文部分内容阅读
抗菌肽是一种具有广谱抗菌活性的天然物质。为了建立一种从山羊乳酪蛋白酶解液中快速有效的分离抗菌肽的方法,抑制牛肉及其制品的主要腐败菌,以期延长其货架期。本课题制备了羧酸基团包覆的磁性纳米颗粒,用于分离羊乳酪蛋白酶解液中的阳离子型多肽。为了检验分离的抗菌肽的活性,以真空包装酱牛肉37℃保温贮藏的腐败菌为测试菌种;定期检测酱牛肉上的菌落,分离出单菌落液体培养后提取DNA测序,得到的碱基序列与数据库相似性比对确定菌种类别;针对牛肉及酱牛肉腐败菌类型的特性,用分离的抗菌肽或复配其它天然抗菌剂测试抑菌效果,为延长牛肉产品的货架期提供可靠的理论数据和方法。主要的工作内容和结果如下:（1）碱共沉淀法制备磁性纳米粒子,聚丙烯酸包覆,进行了表征。扫描电镜观察制备的Fe3O4颗粒是球形的,直径为30 nm,X-射线衍射图证明合成了反尖晶石结构的物质,傅里叶变换红外光谱的吸收峰含有Fe-O键、氨基,说明合成了表面富含氨基的四氧化三铁纳米粒子。聚丙烯酸在碳化亚二胺为脱水剂的条件下与Fe3O4表面的氨基发生缩合反应,用乙醇和蒸馏水洗去多余的溶剂,成功制备了平均直径为600 nm的Fe3O4-COOH磁性微球（称作磁性吸附剂）,用于吸附阳离子型多肽。（2）称取适量烘干的磁性吸附剂加入到一定量的羊乳酪蛋白酶解液中涡旋振荡混合2 min,在磁场作用下磁性分离倒出液体,加入含有1M氯化钠的磷酸盐缓冲液（pH6.0）,振荡混合3 min后除去磁性吸附剂,解吸阳离子型多肽到溶液中,再经浓缩制得肽浓度为8.09 g/L,用于之后的抑菌活性试验。（3）鲜牛肉分割成块状,自封袋包装置于冰温条件下保存,每隔23 d测常见腐败菌菌落数,检测鲜牛肉冰温保存的菌落结构变化。鲜牛肉的初始菌落中乳杆菌属最多,第7 d后假单胞菌和热死环丝菌成为优势菌群,贮藏末期优势腐败菌为假单胞菌属和热死环丝菌属,其次为肠杆菌科和葡萄球菌属。（4）酱牛肉样品用平板计数培养基培养菌落,分离出腐败菌,提取16S rDNA测碱基序列,鉴定有12株属于肠杆菌科,其中9株为阴沟肠杆菌,1株是葡萄球菌属的表皮葡萄球菌,2株为假单胞菌属。选取不同属的3株菌阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌和假单胞菌作为抗菌活性测定的试验菌种;调整菌液为0.5麦氏浊度,抗菌肽对它们的抑菌圈直径分别是14.20±0.03 mm、17.24±0.45 mm和11.30±0.11 mm（孔径7.16 mm）。（5）抗菌肽复配乳酸链球菌素、纳他霉素用于酱牛肉防腐,抗菌肽（0.406 g/kg）复配纳他霉素（0.3 g/kg）组在保温30 d时,菌落总数3.0×104 CFU/g,较空白组3.6×106CFU/g少2个数量级。复配抗菌肽（0.406 g/kg）和乳酸链球菌素（0.5 g/kg）组、仅添加抗菌肽（添加量0.406 g/kg）组在保温贮藏30 d时菌落总数可降低一个数量级。说明抗菌肽能在一定程度上抑制微生物生长,抗菌肽复配纳他霉素组延长酱牛肉的保质期效果最好。