论文部分内容阅读
目的: 巩膜细胞外基质的重塑在近视的形成过程中起着至关重要的作用。既往的研究认为巩膜成纤维细胞负责调控细胞外基质的重塑,但是人们对其调控巩膜细胞外基质合成与降解的机制知之甚少。另外,近期研究表明,形觉剥夺2周后,小鼠巩膜后极部巨噬细胞数量增多,但是巨噬细胞究竟是否参与了近视的形成仍未明了。本研究将分别从1)近视诱导早期成纤维细胞功能差异;2)巩膜渗出型巨噬细胞对小鼠形觉剥夺近视的影响两方面入手,探究两种细胞在近视发生发展中的作用机制。 方法: 本研究以3周龄雄性C57BL/6小鼠为实验动物,实验前经过红外偏心验光仪(EIR)测量小鼠屈光度,筛选双眼屈光参差<3.00D的小鼠入选实验,采用单眼形觉剥夺的方法诱导近视。1)在成纤维细胞功能研究实验部分,小鼠经过2天形觉剥夺后,分别对剥夺眼和对侧眼巩膜组织进行分离与消化,制备成单细胞悬液,利用Fluidigm公司C1TM单细胞全自动制备系统进行单细胞捕获,对捕获的剥夺眼和对侧眼的单细胞转录组进行生物信息学分析。2)在巨噬细胞消除实验部分,将筛选得到的小鼠随机分为2组:形觉剥夺性近视+腹腔注射溶剂组(FDM+lip)和FDM+腹腔注射药物(FDM+clod)消除巨噬细胞组,形觉剥夺周期为2周,实验前后对小鼠进行屈光度,眼轴长度(AL)以及角膜中央厚度(CCT)、前房深度(ACD)、晶状体厚度(LT)、玻璃体腔深度(VCD)的测量。同时对巩膜巨噬细胞进行免疫荧光染色和细胞计数,以明确减少巩膜渗出型巨噬细胞对近视发展的影响。 结果: 1.单细胞转录组差异分析结果表明:巩膜成纤维细胞存在两种有功能差异的亚群:一种以相对低表达胶原为特征,伴随着Nrf2介导的氧化应激反应信号通路、eIF2信号通路和PKA信号通路活化;另一种则相反,以相对高表达胶原为特征。剥夺眼中相对低表达胶原的成纤维细胞比例显著增多(86% vs58%, P<0.05)。 2.巨噬细胞消除实验结果表明:1)FDM+clod小鼠剥夺眼和对侧眼巩膜后极部F4/80+的巨噬细胞数量和CD206+的巨噬细胞数量均比FDM+lip小鼠显著减少(P<0.05);2)单眼形觉剥夺2周后,FDM+clod和FDM+lip组的剥夺眼均成功诱导出了近视;3)减少巩膜渗出型巨噬细胞显著抑制了形觉剥夺小鼠的剥夺眼的轴性近视发展:近视发展受到抑制(P<0.01),眼轴长度(P<0.01)和玻璃体腔深度(P<0.01)的延长也相应受到了抑制。而角膜中央厚度,前房深度和晶状体中央厚度的改变没有显著差异;4)减少巩膜渗出型巨噬细胞也显著抑制了形觉剥夺小鼠的对侧眼的轴性近视发展:近视发展受到抑制(P<0.01),眼轴长度(P<0.05)的延长也相应受到了抑制改变。而玻璃体腔深度的改变有缩短趋势,但没有显著差异。角膜中央厚度,前房深度和晶状体中央厚度的改变没有显著差异。 结论: 1.近视信号传递引起巩膜成纤维细胞产生应激反应,降低其胶原合成水平,可能通过eIF2,Nrf2和PKA三条信号通路调控细胞状态。 2.巩膜渗出型巨噬细胞增多促进小鼠形觉剥夺性近视进展。