转录激活因子样效应蛋白核酸酶（TALEN），是人工制备的可以对选定位置的 DNA序列进行双链切断的核酸内切酶，由 FoKI核酸内切酶结构域和 TALE结构域融合而成，TALENs可以对基因进行定点修饰如基因敲除、基因敲进和基因修改等。　　构建TALENs载体和含有目的基因两侧同源序列的基因打靶载体是开展下游基因定点修饰工作的基础，而 TALENs载体和同源臂打靶载体都是由多个 DNA片段组成的，因此如何快速构建这些多片段连接的基因定点修饰载体是本文研究的主要内容。本实验利用Go lde n ga te克隆方法的基本原理在Too lBo x方法的基础上建立了一套快速、稳定构建TALENs载体的方法；同时进一步改进Go lde n ga te克隆方法，建立了一套可以快速构建同源臂多片段载体的方法。我们分两步构建了一对针对EGFP基因的TALENs载体，每个载体由19个片段连接而成，首先在设计的引物中加入BsaI、BsmBI酶切位点，将PCR扩增的6个片段一组与改造的pMD19-T载体在一个PCR反应管中同时进行酶切和酶连反应；第二步，把3个连入 T载体的质粒与最后的真核表达载体质粒一起进行一步酶切和酶连接反应，最终构建完成TALENs载体。利用改进的Go lde n ga te克隆技术构建了同源臂打靶载体，将pMD19-T载体进行改造，在Lac Z基因两侧加入BsaI酶位点使其能够被多次重复使用，利用相同的方法对pMD19-T中的BsaI酶切位点进行点突变，扩增出的加入BsaI酶切位点的多条同源臂序列，在2天内完成了6个多片段载体的构建，这套系统可以快速构建同源臂打靶载体。　　本实验，摸索了一套构建TALENs载体的系统方法，并且建立快速构建同源臂多片段载体的方法。利用这套方法构建的TALENs载体可以用于基因定点修饰，同源臂载可以和TALENs载体配套使用用于基因敲除、基因敲进和基因修改，同时这套载体构建方法适用于其它其他多片段载体的构建。