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我国是生猪养殖大国,生猪总产值接近1.3万亿,生猪存栏量居世界首位,近5年年均生猪出栏量约为7亿头。对仔猪实施早期断奶措施是集约化现代养猪生产过程中的关键技术之一,该措施具有提高栏舍利用率、提高母猪繁殖性能、缩短生猪出栏时间和有利于防控母子传播性疾病等优点。然而仔猪早期断奶措施会从营养、环境和心理等方面刺激仔猪,加剧断奶应激的发生,引发食欲下降、消化不良、肠道炎症和肠道菌群紊乱等症状,继而导致仔猪发生腹泻甚至死亡。目前,仔猪教槽料中需要添加抗生素来防治早期断奶应激导致的腹泻。然而,随着抗生素的耐药性和食品安全等问题的日益突出,禁用抗生素已经成为一种必然趋势。研发新型高效的益生菌制剂是减少饲用抗生素使用量的重要突破口。贵州从江香猪是一种中国地方猪,具有抗病力强、耐粗饲和肉嫩味美等优良特性。本研究发现与长×大二元杂交商品猪相比,从江香猪具有显著的早期断奶腹泻抗性。那么从江香猪早期断奶后肠道菌群的组成有哪些特征?其变化规律是什么?长×大二元杂交商品猪与从江香猪肠道内是否存在差异微生物可影响早期断奶仔猪的腹泻抗性?其作用机制是什么?这些重要的问题都值得深入探讨。因此本研究旨在系统解析从江香猪早期断奶后肠道微生物的组成及变化规律,并基于粪便微生物移植技术和微生物组学,利用从江香猪资源筛选早期断奶仔猪腹泻抗性相关肠道微生物并阐明其作用机制,同时也探讨了腹泻抗性相关肠道微生物调节早期断奶仔猪肠道上皮屏障功能的作用。本研究结果可为实施肠道菌群干预改善仔猪肠道健康提供科学依据与重要新资料。主要试验思路和结果如下:第一部分贵州从江香猪早期断奶后肠道微生物区系的组成和变化规律的研究1.通过细菌16S rDNA基因高通量测序系统分析了从江香猪早期断奶后两周内肠道细菌的变化规律,发现随着仔猪日龄的增加,其肠道细菌alpha多样性显著降低,24种属水平细菌的相对丰度显著降低而7种属水平细菌的相对丰度显著升高,Prevotella copri是从江香猪肠道内丰度最高的细菌。有17种肠道细菌(包括Lactobacillus coleohominis、Lactobacillusfrumenti、Eubacterium hallii Lactobacillus gasseri LA39等)的相对丰度随着仔猪日龄的增长而显著升高。2.通过真菌internal transcribed spacer(ITS)基因高通量测序系统分析了从江香猪早期断奶后两周内肠道真菌的变化规律,发现随着仔猪日龄的增加,其肠道真菌区系多样性变化不显著,2个属水平真菌的相对丰度显著降低而4个属水平真菌的相对丰度显著升高,Kazachstania telluris是从江香猪肠道内丰度最高的真菌。有3种肠道真菌(Aspergillus sp.、Aspergillus penicillioides 和 Simplicillium sp.)的相对丰度随着仔猪日龄的增长而显著升高。3.Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States(PICRUSt)预测肠道细菌区系功能,结果表明随着仔猪日龄的增长,其肠道细菌区系的碳水化合物和蛋白质消化吸收、多聚糖生物合成和代谢、B族维生素生物合成等代谢功能显著增强,提示了猪肠道微生物的早期定植对宿主的营养消化生理功能具有重要作用。第二部分早期断奶仔猪腹泻抗性相关肠道微生物的筛选及其作用机制研究1.研究发现从江香猪早期断奶后的腹泻程度显著低于长X大二元杂交商品仔猪的腹泻程度,表明从江香猪具有显著的早期断奶腹泻抗性。将从江香猪的粪便微生物移植到长×大二元杂交商品仔猪肠道内可显著缓解其早期断奶腹泻程度,表明粪便微生物移植可传递早期断奶仔猪腹泻抗性。2.细菌16S rDNA基因和真菌ITS基因高通量测序分析表明粪便微生物移植可导致长×大二元杂交商品仔猪肠道微生物区系的beta多样性、alpha多样性、细菌区系的 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)和 Cluster of Ortholog Genes(COG)代谢功能(基于PICRUSt预测)及其物种组成(门、纲、目、科和属水平)向从江香猪仔猪肠道微生物区系的特征转变,证明了粪便微生物移植可有效传递仔猪肠道微生物区系的组成。3.通过比较粪便菌液灌服组和生理盐水灌服组仔猪粪便微生物的相对丰度,筛选出5种与腹泻抗性相关的关键候选微生物(L.frumenti、L.gasseri LA39、Butyricicoccuspullicaecorum、E.hallii 和 Blautia hansenii)。4.动物验证试验结果表明L.gasseri LA39和L.frumenti具有显著的抗腹泻功能,进一步分析表明L.gasseri LA39和L.frumenti介导的腹泻抗性依赖于其分泌的gassericin A 细菌素。5.功能试验表明gassericin A可通过宿主Keratin 19(KRT19)蛋白结合在仔猪肠上皮细胞质膜上,并激活胞内mechanistic target of rapamycin(mTOR)介导的磷酸二酯酶活性,导致环核苷酸水平下调,继而促进肠液吸收相关蛋白的表达并抑制肠液分泌相关蛋白的表达,从而降低早期断奶仔猪的腹泻发生率。第三部分腹泻抗性相关微生物调节早期断奶仔猪肠道上皮屏障功能的研究1.早期断奶前进行L.frumenti灌服处理可显著提高早期断奶仔猪空肠和回肠的绒毛高度,并显著降低血清内毒素和D-乳酸的水平,表明L.frumenti可总体上改善早期断奶仔猪的肠道上皮屏障功能。2.L.frumenti灌服处理可显著增加仔猪肠道紧密连接蛋白(ZO-1、Ocludin和Claudin-1)的表达量,对仔猪肠道黏液蛋白基因表达和杯状细胞数量没有显著影响,可显著增加仔猪血清IgG、肠道sIgA水平和IFN-γ的水平,表明L.frumenti可增强早期断奶仔猪肠道上皮物理屏障功能和免疫屏障功能,但对化学屏障功能没有显著影响。3.L.frumenti灌服处理可显著增加仔猪肠道有益微生物(L.frumenti、L.gasseri LA39、Parabacteroides distasonis和K.telluris)的相对丰度,显著降低有害微生物(Desulfovibrio desulfuricans 和 Candida humilis)L.frumenti可增强早期断奶仔猪肠道上皮微生物屏障功能。综上所述,本研究的主要结论为:1.从江香猪早期断奶后肠道微生物区系(尤其细菌区系)发生了显著变化,P.copri和K.telluris分别是丰度最高的肠道细菌和真菌。一些微生物(包括L.coleohomimis、L.frumenti.E.hallii和L.gasseri LA39 等)的相对丰度随着仔猪日龄的增长而显著升高,可能是潜在的有益微生物。2.L.gasseri LA39和L.frumenti具有显著的早期断奶仔猪腹泻抗性功能,作用机制为L.gasseri LA39和L.frumenti分泌的gassericin A细菌素可通过与宿主KRT19蛋白互作结合在仔猪肠上皮细胞质膜上,促进肠液吸收相关蛋白的表达并抑制肠液分泌相关蛋白的表达。L.frumenti灌服处理可总体改善早期断奶仔猪肠道上皮屏障功能,主要通过增强肠道上皮物理屏障功能、免疫屏障功能和微生物屏障功能。