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研究背景结直肠癌排在世界范围内常见恶性肿瘤的第三位,其致死率位居因癌症致死病例的第四位。近年来我国的结直肠癌发病率亦呈上升趋势,且以每年4%的幅度递增,递增速度为世界平均水平的二倍。外科手术仍是目前治疗结直肠癌的核心手段,围绕手术开展的化学治疗虽然能在一定程度上延长患者的生存时限,却无法回避针对性差、毒副作用大等缺陷。因此,以靶向治疗策略为指导研发新型的抗癌药物与治疗手段显得尤为必要。随着生物技术在医学领域的快速发展和从细胞分子水平对发病机制的深入认识,肿瘤生物治疗已进入了一个全新的时代。肿瘤分子靶向治疗是利用具有一定特异性的载体,将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位,把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内,而不影响正常细胞、组织或器官的功能,从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。靶向治疗分为三个层次,第一种是针对某个器官,例如某种药物只对某个器官的肿瘤有效,这个叫器官靶向;第二种叫细胞靶向,故名思义,指的是只针对某种类别的肿瘤细胞,药物进入体内后可选择性地与这类细胞特异性地结合,从而引起细胞凋亡;第三种是分子靶向,它指的是针对肿瘤细胞里面的某一个蛋白家族的某部分分子,或者是指一个核苷酸的片段,或者一个基因产物进行治疗。分子靶向治疗是目前肿瘤治疗的一个“闪光点”,凭着它的特异性和有效性,已取得很大成功,是目前国内外治疗的“热点”。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是肿瘤血管生成研究领域的中心焦点,它不仅在肿瘤的生长和转移中发挥重要的作用,而且对肿瘤细胞本身的增殖和凋亡也有一定的影响。目前至少已发现5种VEGF分子,即VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206和VEGF145,它们是同一基因经过mRNA不同方式的拼接而成,其中VEGF121和VEGF165是最重要的两种异构体形式。VEGF受体包括VEGFR-1/flt-1、VEGFR-2/KDR/flk和VEGFR-3/flt-4。但能与VEGF特异性结合的只有前两种,VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管内皮细胞表达,但现在也有在肿瘤细胞表面发现。大量研究结果表明VEGF在许多癌组织中过量表达,VEGF及其受体在肿瘤的生长和转移中起关键作用,以VEGF/VEGFR为靶标的抗肿瘤药物与传统的肿瘤治疗药物相比有很大的优势,目前已有大量针对该靶标的药物进入临床实验阶段或已应用于临床。针对VEGF/VEGFR的靶向治疗,除了抑制VEGF与VEGFR的方法外,还有抑制VEGF与其配体结合后的信号转导通路和基因疗法。小分子VEGF受体酪氨酸酶抑制物（Receptor tyrosine kinase inhibitors,RTKIs）包括Sunitinib、Sorafenib、PTK-787、Zactima和AG-013736等。在实体肿瘤的恶性演进中,细胞外间质微环境起着重要的调控作用。肿瘤组织的氧分压[p（O2）]为0～20mmHg（1mmHg=0.1133kPa）,而正常组织则为40mmHg以上。低氧乃实体肿瘤物理微环境的基本特征。一方面,缺氧时细胞膜Na-K泵功能低下,溶酶体破裂,并激活核酸内切酶,引发细胞坏死、凋亡。另一方面,低氧是诱导VEGF表达的最强刺激因素,它可以通过增加VEGF的表达而调节肿瘤内部血管的生成和促进肿瘤细胞的生长。反义技术通过阻抑从DNA到mRNA的转录过程或从mRNA到蛋白质的翻译过程而阻断细胞中蛋白质的合成,它可分为反义DNA、反义mRNA和自催化性核酶,其中最常用的是反义寡核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）,它具有高度靶特异性、设计容易、多样且合成简单的特点,这都是常规药物设计、生产和作用所不可比拟的,因而具有巨大的研究价值.另外,ASODN进入细胞内与细胞周期无关,既可进入增殖期细胞又可进入非增殖期细胞.它不含病毒序列,不会产生免疫反应,也不会整合入宿主染色体内.由于以上优点,反义技术目前已在恶性肿瘤的基础研究和临床应用上取得巨大发展。以往的研究在VEGF是否对肿瘤细胞的本身的生长也发生作用上存在争议,基于以上的国内外研究概况,本实验人工合成反义VEGF寡核苷酸,用脂质体转染入缺氧条件下生长的人大肠癌HT-29细胞,运用反转录PCR和免疫印迹的方法检测VEGF及其受体的表达情况,运用MTT和流式细胞术检测大肠癌细胞的增殖和凋亡情况。目的体外简单模拟肿瘤细胞生长的缺氧微环境,探索人工合成的反义VEGF寡核苷酸对体外缺氧条件下生长的人大肠癌细胞VEGF及KDR表达的影响,以及对细胞本身的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论和实验依据。方法根据文献用CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境,细胞在正常氧浓度下培养24h后加入CoCl2,终浓度为150μmol/L;缺氧条件下培养48h后用RT-PCR检测VEGF及其受体KDR的mRNA表达水平,培养72h后免疫印迹法检测二者蛋白水平的表达,与正常氧条件下的对照组做比较;缺氧条件下培养12h后用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸（ScrambledOligodeoxynueleotide,SODN）人大肠癌细胞株HT-29,转染48h后RT-PCR检测各组细胞VEGF及KDR mRNA,分别与脂质体对照组比较;Western blot测定转染48h、72h后VEGF及KDR蛋白的表达水平,与对照组做比较;MTT法检测细胞的增殖情况,ASODN组设400nmol/L、600nmol/L、800nmol/L和1000nmol/L四个浓度,SODN组浓度为1000nmol/L,另设脂质体对照组,以上各组分别设24h、48h、72h和96h四个时间点,结果用方差分析的方法进行统计学处理;转染72h后用流式细胞术检测细胞凋亡情况,与对照组比较。结果（1）正常组（0.442±0.026）HT-29细胞VEGF mRNA的表达水平与缺氧组（0.914±0.015）比较有统计学意义（P<0.01）。缺氧条件下,VEGF蛋白的表达条带（0.919±0.004）明显强于正常条件下生长的HT-29细胞VEGF蛋白的条带（0.420±0.011）（P<0.01）（2）VEGF mRNA的表达组间有统计学差异（F=2299.046,P<0.01）,ADODN组（0.455±0.022）低于脂质体对照组（0.934±0.018）和SODN组（0.915±0.005）（P<0.01）。脂质体对照组与SODN组之间无显著差异（P>0.05）。KDR mRNA水平组间有统计学差异（F=671.060,P<0.01）,ADODN组（0.374±0.020）明显低于SODN组（0.801±0.032）和脂质体对照组（0.797±0.032）（P<0.01）。后两组之间无统计学差异（P>0.05）;（3）Western blot证实在HT-29细胞中存在分子量为21kDa和200kDa的特异性条带,分别与VEGF和KDR的分子量相符,VEGF蛋白的表达组间有统计学差异（F=14706.116,P<0.01）,ADODN48h及72h组灰度值均低于脂质体对照组和SODN组（P<0.01）;72h弱于48h（P<0.01）,脂质体对照组与SODN组之间无统计学差异（P>0.05）;KDR蛋白表达水平组间有统计学差异（F=8593.048,P<0.01）,ADODN48h及72h组灰度值均低于脂质体对照组和SODN组（P<0.01）;72h弱于48h（P<0.01）,脂质体对照组与SODN组之间无统计学差异（P>0.05）;（3）MTT结果显示,各时间点的细胞增殖有差异（Ftime=4321.096 P<0.001）,各处理组的细胞增殖也有差异（Fgroup=1988.745 P<0.001）,时间和组别有交互效应（F交互=503.131 P<0.001）。在两两比较中,各个时间点之间的抑制率均有差异（P<0.05）;除脂质体对照组与SODN组之间差异无统计学意义外（P>0.05）,各处理组两两之间也均存在差异（P<0.001）。在脂质体组和SODN组内,各个时间点的抑制率无明显差异（P>0.05）,而在ASODN的各浓度组内,各个时间点之间的抑制率均有差异（P<0.05）;（4）流式细胞检测结果,VEGF ASODN对HT-29细胞有一定的凋亡诱导作用（25.31±4.62）%,与对照组（3.06±0.64）%比较有统计学意义（P<0.05）。结论低氧促进VEGF的表达,并通过正反馈机制上调KDR的表达,LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN通过抑制VEGF的基因表达,对体外低氧条件下生长的人大肠癌HT-29细胞的增殖进行抑制,并有一定的凋亡诱导作用。