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目的:1.增龄对大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell)损伤和自噬水平的影响;2.研究淫羊藿苷(Icariin)对衰老大鼠睾丸Sertoli细胞损伤和自噬水平的调节作用;3.体外探究淫羊藿苷对小鼠睾丸Sertoli细胞株TM4细胞损伤的调节作用及机制。方法:1.分4批购买2月龄的SPF级SD♂大鼠饲养至同一时间至各组大鼠分别为6、12、18和24月龄,每组10只,称重,腹腔注射20%乌来糖(5 m L/kg)进行麻醉,放血处死,检测以下指标:(1)HE染色法观察各年龄组大鼠睾丸组织形态学变化;(2)免疫荧光法标记睾丸Sertoli细胞标记物SOX9,观察增龄过程中大鼠睾丸Sertoli细胞数量变化;(3)双标免疫荧光法检测增龄过程中大鼠睾丸Sertoli中自噬相关蛋白ATG5和LC3的表达变化;(4)透射电镜观察增龄过程中大鼠睾丸Sertoli中自噬相关超微结构的变化。2.购买2月龄SPF级SD♂大鼠饲养至16月龄时,按体质量随机区组法分为3组:衰老模型组、淫羊藿苷低和高剂量组;此时,另购买一批2月龄SPF级SD♂大鼠作为青年对照组,以上各组大鼠每组均为10只。淫羊藿苷低和高剂量组大鼠分别给予2和6 mg/kg的含药饲料进行饲养,同时青年对照组和衰老模型组大鼠给予普通维持饲料饲养。以上各组大鼠在相同环境下持续饲养4个月,称重,经乌来糖麻醉后放血处死,检测以下指标:(1)称取睾丸和附睾重并计算其指数;(2)取附睾检测精子密度及活率;(3)ELISA法检测各组大鼠睾丸组织睾酮(T)水平;(4)HE染色法观察各组大鼠睾丸组织形态学变化;(5)免疫荧光法标记大鼠睾丸中Sertoli细胞,观察各组大鼠睾丸Sertoli细胞数量变化;(6)Western blot法检测各组大鼠睾丸Sertoli细胞分泌的相关细胞因子(GDNF、SCF、BMP4和PLZF)蛋白表达水平的变化;(7)双标免疫荧光法检测各组大鼠睾丸Sertoli细胞中ATG5和LC3蛋白表达变化;(8)透射电镜法观察各组大鼠睾丸Sertoli细胞中自噬相关超微结构的变化。3.1给予TM4细胞不同浓度(12.5、25和50μM)氯喹(Chloroquine,CQ)刺激24 h后,检测如下指标:(1)光镜观察不同浓度CQ对TM4细胞形态的影响;(2)Hoechst33342染色观察不同浓度CQ对TM4细胞凋亡的影响;(3)Western blot法检测不同浓度CQ对TM4细胞中LC3和P62蛋白表达水平的影响;(4)透射电镜法观察不同浓度CQ对TM4细胞自噬相关超微结构的影响。3.2将TM4细胞分为Control组、CQ组、Icariin+CQ和Icariin组,待TM4细胞贴壁生长后,Icariin+CQ组和Icariin组加入Icariin(终浓度为0.5μM)预保护24 h,然后CQ组和Icariin+CQ组加入CQ(终浓度为50μM)继续培养24 h,检测如下指标:(1)光镜观察淫羊藿苷对TM4细胞形态的影响;(2)Hoechst33342染色检测淫羊藿苷对TM4细胞凋亡的影响;(3)Western blot法检测淫羊藿苷对TM4细胞中LC3和P62蛋白表达水平的影响;(4)透射电镜观察淫羊藿苷对TM4细胞自噬相关超微结构的影响。结果:1.(1)HE染色结果显示,6月龄和12月龄大鼠睾丸组织形态良好,随着年龄的增长,大鼠睾丸组织形态逐渐出现退行性改变。18月龄大鼠睾丸组织中部分生精小管开始出现萎缩,24月龄大鼠睾丸生精小管出现严重萎缩且伴随生精细胞脱落、细胞间间隙变大等现象。统计结果显示睾丸生精小管直径和生精上皮厚度在6月龄时维持在较高水平,从12月龄开始下降,18月龄和24月龄则进一步下降;(2)免疫荧光结果显示,6和12月龄大鼠睾丸组织中Sertoli细胞数量变化不明显,18和24月龄大鼠睾丸组织中Sertoli细胞数量显著下降;(3)免疫荧光结果显示,随着年龄增加,大鼠睾丸Sertoli细胞自噬相关蛋白ATG5和LC3表达均逐渐下降;(4)透射电镜结果显示,6月龄大鼠睾丸Sertoli细胞胞浆中可见较多自噬泡结构,各细胞器丰富且形态良好;12和18月龄大鼠睾丸Sertoli细胞胞浆中自噬泡数量略有减少,空泡增多且内质网出现肿胀,线粒体出现峭紊乱;24月龄大鼠睾丸Sertoli细胞胞浆中自噬泡很罕见,可见大量空泡,内质网和线粒体等细胞器损伤严重。2.(1)淫羊藿苷可显著升高自然衰老大鼠睾丸重、睾丸指数、附睾重和附睾指数;(2)淫羊藿苷可显著提高自然衰老大鼠附睾精子密度和活率;(3)ELISA结果显示,淫羊藿苷可显著升高自然衰老大鼠睾丸组织中T水平;(4)HE结果显示,淫羊藿苷可明显改善自然衰老大鼠睾丸组织形态学变化,显著增加生精小管直径和生精上皮厚度;(5)免疫荧光结果显示,淫羊藿苷可显著增加自然衰老大鼠睾丸Sertoli细胞数量;(6)Western blot结果显示,淫羊藿苷可显著上调自然衰老大鼠睾丸Sertoli细胞分泌的相关细胞因子GDNF、PLZF、SCF和BMP4蛋白表达水平;(7)免疫荧光结果显示,淫羊藿苷可明显升高衰老睾丸Sertoli细胞ATG5和LC3蛋白表达;(8)透射电镜结果显示,淫羊藿苷可明显增加自然衰老大鼠睾丸Sertoli细胞中自噬泡数量,减少胞浆中受损线粒体和内质网等相关细胞器的堆积。3.1(1)光镜结果显示,Control组TM4细胞呈长梭形;12.5μM的CQ刺激24 h后,TM4细胞形态学并未发生明显改变;随着CQ刺激浓度的增加,TM4细胞形态学发生显著变化,形态异常的圆形或椭圆形的细胞数量增多;(2)Hoechst33342染色结果表明,Control组TM4细胞核经Hoechst染色后呈圆形,淡蓝色;12.5μM的CQ处理TM4细胞后,Hoechst染色变化不明显;25和50μM的CQ处理后,Hoechst染色镜下可见染色质浓缩、核固缩,深染呈亮蓝色的TM4细胞逐渐增多,表明CQ可导致TM4细胞凋亡逐渐增加;(3)Western blot结果显示,12.5μM的CQ即可引起TM4细胞中LC3Ⅱ和P62的蛋白表达水平的增加;随着CQ浓度升高,TM4细胞LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平逐渐上升,且具有显著性差异;(4)透射电镜结果显示,12.5μM的CQ处理TM4细胞后对自噬体和自噬溶酶体的数量并无明显影响;随着CQ刺激浓度的增加,25μM的CQ可引起TM4细胞中自噬体和自噬溶酶体的数量增加,胞浆中受损细胞器也逐渐增加;50μM的CQ刺激可导致TM4细胞中自噬体和自噬溶酶体数量进一步增加,自噬泡中待消化物质发生蓄积,胞浆中受损细胞器进一步增加。3.2(1)光镜结果显示,与Control组比较,CQ组TM4细胞形态学发生明显改变,淫羊藿苷对正常TM4细胞形态无明显影响;与CQ组相比,淫羊藿苷可明显减轻CQ对TM4细胞的形态的损伤作用,形态异常的圆形或椭圆形细胞数量下降;(2)Hoechst33342染色结果表明,淫羊藿苷可减轻CQ所致的TM4细胞凋亡,对正常TM4细胞无明显影响;(3)Western blot结果显示,与Control组相比,CQ组TM4细胞中自噬关键蛋白LC3Ⅱ和P62表达水平显著增加,而Icariin组TM4细胞LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平无显著变化;与CQ组相比,Icariin+CQ组TM4细胞中LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平显著降低;(4)透射电镜结果显示,与Control组相比,CQ组TM4细胞胞浆中自噬小体增多,胞浆中有大量聚集的自噬溶酶体,胞浆中受损细胞器增多,而淫羊藿苷并未引起正常TM4细胞胞浆中自噬小体和自噬溶酶体堆积现象;与CQ组相比,Icariin+CQ组TM4细胞胞浆中自噬小体和自噬溶酶体堆积现象有所减轻。结论:1.增龄可导致大鼠睾丸Sertoli细胞损伤,自噬水平下降。2.淫羊藿苷可明显改善衰老所致大鼠睾丸生精功能衰退,其作用机制可能与调节Sertoli细胞自噬水平,减轻Sertoli细胞损伤有关。3.抑制自噬可导致Sertoli细胞损伤,而淫羊藿苷可通过激活自噬减轻Sertoli细胞损伤。