目的：重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage stimulating factor，rhGM-CSF）是由骨髓分化而成，并可由骨髓前提细胞分离得到，它是一种非糖基化的水溶性蛋白质，由127个氨基酸组成。rhGM-CSF的主要作用是对粒细胞系和单核细胞系细胞的维持存活、促进生长、诱导分化和增强功能等。基于临床研究的应用中发现rhGM-CSF应用于烫伤、烧伤等疾病领域，并显示了良好的疗效。　　 目前，临床上主要采用注射剂含漱等治疗途径，考虑到局部外用治疗，并保证安全、有效、稳定、使用方便的前提，本课题研制了rhGM-CSF外用溶液剂型，主要用于皮肤的烫伤、烧伤等疾病。它可直接作用于患病部位，从而避免肝脏的首过效应和胃肠道的降解反应及有关的副作用，携带使用方便。　　 方法：本实验选择重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子发酵液作为提取材料，在预试验的基础上初步确定重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的制备方法。将大肠杆菌表达的rhGM-CSF经过超声波破碎后收集包涵体，通过包涵体的变性和复性操作得到粗提的蛋白质，通过层析步骤得到提纯的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子原液。　　 rhGM-CSF外用溶液处方设计与筛选试验分别考察了pH筛选，稳定剂的筛选，透皮吸收促进剂的筛选。为了考察pH值对rhGM-CSF外用溶液.的生物活性的影响，在处方中其他成分用量固定的前提下，将不同用量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠对试验样品pH值的影响。本试验选择不同的稳定剂加入到制剂当中，HT、DB、TG和GT，通过25±2℃加速试验，以选择最佳的保护剂。确定保护剂后，在其他组分固定的情况下，将保护剂按照不同比例，加到样品当中，通过25±2℃加速30天，最终确定处方用量。本试验选择TW、BZ、SD作为参考，通过25±2℃加速试验来考察它们对于制剂稳定性的影响。最后确定了rhGM-CSF外用溶液的最佳处方。　　 处方确定后进行稳定性考察，制备了三批GM-CSF制剂样品，置于40±2℃，254±2℃，2～10℃三种条件下放置，以考察任何rhGM-CSF外用溶液样品的外观、pH值、生物活性、无菌检查等方面的变化情况。　　 结合《中国药典》中rhGM-CSF产品的要求及通则中对外用溶液产品的要求，制订了GM-CSF外用溶液的质检规程草案。分别对样品外观、pH值、效价测定、蛋白含量测定、装量、无菌等方面进行了研究。　　 rhGM-CSF外用溶液治疗烧伤的药效试验：选用家兔为试验模型，构建浅Ⅱ度烧伤实验模型，随机分组，分别涂抹rhGM-CSF外用溶液（70μg/ml、35 μg/ml、15gg/ml）、rhGM-CSF原液（35 μg/ml）、外用溶液空白溶液、生理盐水，每次涂抹3下，每次涂抹共约0.4ml，每天定时给2次，连续7天。　　 rhGM-CSF外用溶液用于治疗烫伤的药效学实验，选用家兔为试验模型，构建烫伤模型，随机分组，每只家兔的六处创面分别给予的药物为：rhGM-CSF外用溶液70 μg/ml、35μg/ml、15 μg/ml、rhGM-CSF原液35μg/ml、外用溶液空白溶液、生理盐水。每次涂抹3下，每次涂抹共约0.4ml，每天定时给2次，连续7天。　　 rhGM-CSF外用溶液对动物皮肤急性毒性试验，观察rhGM-CSF外用溶液对家兔完整皮肤及破损皮肤短期接触所产生的毒性反应。急性毒性试验和资料，是对药物一次性给予大剂量的安全性考察，按照皮肤急性毒性的试验要求，受试药物剂量超过有效浓度的20倍时，仍未出现异常反映或死亡，即可提示药物的安全性。参考药效试验中的高剂量70 μg/ml，此实验设计了1.4mg/ml。　　 rhGM-CSF外用溶液刺激性研究，试验包括皮肤过敏试验和皮肤刺激试验。实验动物为豚鼠，按体重性别随机均分组，每组5只雌雄各半。通过动物皮肤接触受试物后，观察机体免疫系统反应在皮肤上的表现或观察药物对家兔皮肤多次给药所产生的刺激反应。　　 结果：按照试验设计从发酵液中提取rhGM-CSF原液。在筛方试验中将不同pH值的试验样品通过25±2℃加速30天，实验结果显示，磷酸氢二钠的用量为29g/L，磷酸二氢钠的用量为2.0g/L时，样品pH值约为7.2，此时对rhGM-CSF外用溶液的生物活性影响小。　　 通过25±2℃加速试验，选择最佳的保护剂为HZT.。在其他组分固定的情况下，将HZT.按不同比例，加到样品当中，通过25±2℃加速30天，实验结果显示，HZT.用量为300g时，活性损失最小，当其浓度再增加时，就会导致样品溶液粘度增加，最终确定处方用量为300g/L。通过透皮剂研究选择SD.作为制剂中的透皮吸收促进剂。　　 处方确定后样品稳定性考察，通过三批样品40±2℃、25±2℃条件下的初步稳定性考察、4-8℃长期稳定性，GM-CSF外用溶液样品的外观、pH值、无菌检查、生物活性等各项指标均未发生明显变化，样品稳定性较好。通过质量研究起草了rhGM-CSF外用溶液的质检规程草案。　　 rhGM-CSF外用溶液治疗烧伤的药效试验中可以看到，rhGM-CSF外用溶液组给药后，烧伤创面愈合明显加快，用t检验方法分析。试药组与对照组比较有显著差异，原液组与外用溶液空白溶液组比较也有明显差异，表明rhGM-CSF外用溶液组与原液组对烧伤均有明显的治疗作用，外用溶液组较原液组效果好一些，说明制剂组方的合理性。　　 rhGM-CSF外用溶液用于治疗烫伤的药效学实验中可以看到，rhGM-CSF外用溶液组给药后，烫伤创面愈合明显加快，用t检验方法分析，试药组与对照组比较有显著差异，原液组与外用溶液空白溶液组比较也有明显差异，表明rhGM-CSF外用溶液组与原液组对烫伤均有明显的治疗作用，外用溶液组较原液组效果好一些，说明制剂组方的合理性。　　 rhGM-CSF外用溶液对动物皮肤急性毒性试验表明：各组家兔均活泼健康，饮食活动等都未见异常。剂量已超过预计临床用量的20倍以上。提示rhGM-CSF外用溶液对皮肤无毒副作用，临床用药安全。　　 局部刺激性实验表明：给rhGM-CSF外用溶液和外用溶液空白溶液组动物均未出现明显红斑和水肿，表明rhGM-CSF外用溶液对皮肤为弱致敏性。观察药物对家兔皮肤多次给药所产生的刺激反应，受试家兔均未出现明显红斑和水肿（分值<0.5）表明rhGM-CSF外用溶液对家兔皮肤无刺激性。通过对动物的皮肤过敏性试验、刺激性试验证明了rhGM-CSF外用溶液外用是安全的。　　 结论：本课题研制的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子外用溶液，以HZT.等为辅料，主要用于皮肤的烫伤、烧伤等疾病。充分发挥了生物制药的优势具有作用机理明确，毒副作用小等特点。本课题研制的rhGM-CSF外用溶液质量可控，稳定性好，可直接作用于患病部位，作用时间长，携带使用方便。