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研究背景:乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国目前严重的公共卫生问题,患者可从急性感染发展至慢性感染,肝硬化甚至肝癌。目前主要采用以核苷类似物（NAs）为主的抗病毒药物治疗,但是无法彻底清除病毒并且停药后容易复发。HBV抗原特异性CD8+T细胞介导的细胞免疫应答在机体清除病毒的过程中起到关键作用,病毒感染的靶细胞通过HLA-A,B,C等HLA I类分子递呈HBV抗原肽被CD8+T细胞识别,后者分化为CTL启动对靶细胞的特异性杀伤,达到清除病毒的目的。人群中HLA I类分子的等位基因呈高度多态性,不同HLA I类分子递呈抗原肽的种类和能力有明显差异,因此不同患者的HBV抗原特异性CD8+T细胞免疫应答强度也不相同。定量检测患者HBV抗原特异性CD8+T细胞,能够了解乙型肝炎患者真实的细胞免疫功能状态,为临床监测疾病进程、评估抗病毒治疗效果和改进治疗方案以及预测停药后复发风险等提供新的免疫学指标,促进精准医疗的实行。研究目的:预测并验证在中国人群中基因频率分别为3.9%、6.1%、9.5%的HLA-A0203,A0206,A0207三种HLA-A分子限制性的HBV抗原表位肽的免疫原性;整合本课题组其他所有已被验证具有免疫原性的HBV抗原表位肽建立肽库,采用IFN-γELISPOT技术为检测方法,研发HBV抗原特异性CD8+T细胞定量检测试剂盒,并检测临床乙肝患者血液标本,初步探讨定量检测HBV抗原特异性T细胞的临床意义。研究方法:（1）通过5种抗原表位肽预测数据库预测及筛选分别被HLA-A0203、A0206、A0207三种HLA-A分子所限制的来源于HBs Ag、HBe Ag（HBc Ag）、HBpol和HBx Ag等HBV蛋白的抗原表位肽作为待鉴定表位肽。将待鉴定表位肽分为3组混合肽,收集临床乙肝患者的外周抗凝血,从中分离出外周血单个核细胞（PBMC）,通过IFN-γELISPOT实验验证对混合肽产生阳性反应的患者,再回抽这些患者外周血分离PBMC,再次通过IFN-γELISPOT实验验证混合肽中每种单肽的免疫原性;（2）整合本课题组目前经过免疫原性验证的、被基因频率大于1%的所有13种HLA-A分子提呈的HBV抗原表位肽,挑选免疫原性较强的105条,分成7个检测肽库,组装成ELISPOT检测试剂盒,用于检测乙肝患者HBV抗原特异性的、具有免疫反应活性的记忆或活性型CD8+T细胞的数量;检测临床乙肝患者外周血标本,分析试剂盒的重复性、稳定性以及标本在不同保存条件下的检测效果;（3）收集81乙型肝炎患者的临床外周血标本,使用本试剂盒检测HBV抗原特异性CD8+T细胞,初步确立试剂盒的参考值供临床参考;对13名正处于抗病毒治疗阶段的慢性乙肝患者进行动态分析,每隔三个月定量检测患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量,并结合其他实验室指标初步探究HBV抗原特异性CD8+T细胞定量检测在疾病进程监测以及评估抗病毒治疗效果等方面的临床意义。研究结果:（1）通过5种表位肽预测数据库预测并筛选出被HLA-A0203、A0206和A0207分子限制的待鉴定表位肽20条,通过IFN-γELISPOT法从150例乙肝患者中筛选出19例对待验证混合表位肽产生CTL反应的阳性患者,再对单种表位肽进行验证,最终获得7条具有真实免疫原性的HBV抗原表位肽,根据阳性患者的HLA-A基因分型结果和HLA限制性虚拟预测结果初步确认其中1条为HLA-A0203限制性,2条为HLA-A0206限制性,4条为HLA-A0207限制性。（2）将本课题组验证的105条被13种HLA-A分子限制的HBV表位肽分成7个肽库,组装成HBV抗原特异性CD8+T细胞定量检测试剂盒（ELISPOT法,11人份/99孔/盒）。每份检测血样设置7个抗原肽库实验孔,1个无多肽刺激的阴性对照孔以及1个经丝裂原PHA刺激的阳性对照孔。稳定性实验显示在4℃保存条件下试剂盒的稳定性至少维持5个月无显著变化;重复性检测中批内实验CV值均<15%,批间实验CV值均<20%,符合我国酶联免疫反应实验的标准;标本在不同保存条件下的检测结果显示:血样在4℃和室温下保存时间延长可使检测结果下降,临床检测需根据实际情况进行选择并统一血样保存时长,建议在室温保存6小时内开始检测;分离出患者的PBMC后立即检测与培养过夜后再检测的结果则无明显差异,临床检测时推荐将患者PBMC分离出来后过夜培养以免进行夜班操作。（3）使用本试剂盒检测了81例乙肝患者,检测结果（SFU/2×10~5 PBMCs）经统计分为低、中、高三档参考值:低档0-14,中档14-140,高档>140,分别占乙肝患者群体的15%、70%和15%,可供临床检测参考;对其中的13名抗病毒治疗的慢乙肝患者进行三个月一次的动态检测,目前每位患者完成2次检测,其中8人HBV抗原特异性CD8+T细胞数量明显上升,2人无明显变化,3人呈现下降趋势。结论:验证了7条具有免疫原性的被3种HLA-A分子限制的HBV抗原表位肽;成功研发了HBV抗原特异性CD8+T细胞定量检测试剂盒;检测了81例乙肝患者血标本,获得了初步的临床参考值;对13例抗病毒治疗的慢乙肝患者完成了2次间隔3个月的动态检测,并结合其他实验室指标初步探讨特异性T细胞定量在疾病进展与抗病毒治疗效果评价中的临床意义。该试剂盒的研发填补了国内外市场空白。