论文部分内容阅读
目的:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是慢性牙周炎病变区域或活动部位最主要的优势菌,该菌通过其主要黏附因子菌毛蛋白A(fimbria proteinA,FimA)黏附并入侵牙龈上皮细胞,与Pg毒力密切相关;同时FimA是Pg的表面抗原成分,具有良好的免疫反应性。本实验克隆了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因,使其在大肠杆菌中正确表达,纯化,旨在为研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒提供抗原。
方法:利用PCR 方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建原核表达质粒PT-BAD/fimA,获得在大肠杆菌中的表达,基体辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定重组蛋白。以不同浓度咪唑缓冲液(250uM、200 uM、150 uM、100 uM、50 uM)洗脱结合在His-tag 纯化柱的目的蛋白,选择最佳洗脱浓度。
结果:克隆基因测序结果与GenBank 数据库中的序列呈现99.9[%]同源性;诱导表达后可观察到Mr 38kDa的融合蛋白,经MALDI-TOFMS检测进一步证实为FimA蛋白。100Um 咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度最高,得到纯度为95[%]的目的蛋白。
结论:本实验成功克隆了Pg fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到大量纯度较高的FimA蛋白,为后续研究奠定了基础。