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本研究探讨、构建、优化了水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）五个基因（NS2、NS3、CP、SP和NSvc4）的“AcMNPV-sf9昆虫细胞”真核表达体系（苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，Autographa California nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV；草地贪夜蛾，Spodoptera frugiperda，sf9），以获得具有天然活性的RSV蛋白，制备相应的抗血清。同时，本实验还分别构建了GFP-CP（RSV外壳蛋白）及GFP-SP（RSV病害特异蛋白）融合基因表达载体，直观地研究CP、sP基因在sf9昆虫细胞中的表达情况。首先用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）方法获得RSV的五个基因NS2、NS3、CP、SP和NSvc4，并将它们克隆至pMD-18T载体上。得到的重组质粒pMD18T-NS2，pMD18T-NS3，pMD18T-CP，pMD18T-SP经XbaⅠ／HindⅢ双酶切，分别与经相同方法酶切的杆状病毒转移载体pFastBacHTb相连接构建成重组转移质粒pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP。而重组质粒pMD18T-NSvc4则通过KpnⅠ／HindⅢ位点双酶切与pFastBacHTb相连接成重组转移质粒pFastBacHTb-NSvc4。序列测定表明目的基因准确地插入到表达载体。然后，重组转移质粒pFastBacHTb-X（pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP、pFastBacHTb-SP和pFastBacHTb-NSvc4）通过转化包含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌（Escherichia coli，E．coli）感受态细胞DH10Bac，得到重组穿梭质粒rb-X（rb-NS2、rb-NS3、rb-CP、rb-SP和rb-NSvc4）。rb-X转染sf9昆虫细胞，收获地第一代重组杆状病毒，命名为P1-X。在荧光倒置显微镜可见光200倍视野下观察到：rb-X侵染sf9细胞24 h～72 h后，细胞增大，培养液和细胞内出现颗粒状物质，部分细胞破裂甚至裂解。通过四次再侵染新鲜sf9昆虫细脆，获得第四代重组杆状病毒P4-X，其病毒复数（multiplicity of infection，MOI）达到5。噬菌斑纯化鉴定实验可见每个P4-X重组病毒母株都可长出10个以上灰色菌落，表明重组病毒滴度达到1×107pfu／mL（plaque forming units／mL）以上，可用于蛋白表达。分别收集被侵染24 h、48 h、72 h和96 h的细胞和上清，提取蛋白进行SDS-PAGE电泳。Genesnap软件分析结果显示：①从细胞提取的蛋白，进行电泳后分别出现：28.2 kD、29.2 kD、40.2 kD、25.2 kD和37.2 kD大小的条带，与预测的五种融合蛋白的大小基本一致，而培养基上清提取蛋白电泳则没有目的条带出现。②同一种目的蛋白条带的浓度随着细胞被侵染时间的增加而增加；③P4-CP和P4-SP侵染细胞48h～96h时，CP和SP的浓度基本保持在5×Marker水平。这些结果表明：RSV编码的这五个蛋白属于非分泌型蛋白且在"AcMNPV-sf9昆虫细胞”表达体系中能成功表达；在侵染细胞后的96 h内，RSV各蛋白的表达量随着时间增加呈上升趋势，且CP、SP在这个真核表达体系中能较快、持续地进行大量表达。NS2，CP和SP的Western-blotting印迹分析得到单一条带，表明所制备的抗血清特异性强。过Ni+-NTA柱纯化NS3蛋白，SDS-PAGE分析得到单一的目的蛋白条带，且条带大小与预测的分子量大小相吻合。将获得的NS3蛋白免疫大耳白兔制备专化性抗血清，间接ELISA法测定其抗血清效价为1：9600。用重叠延伸PCR（overlap polymerase chain reaction，overlap-PCR）方法获得了GFP-CP、GFP-SP两者的融合基因，并将其克隆至载体pMD-18T，得到重组质粒pMD18T-GFP-CP和pMD18T-GFP-SP。重组质粒经XbaⅠ／HindⅢ双酶切，与经相同方法酶切的杆状病毒转移载体pFastBacHTb相连接构建成重组转移质粒pFastBacHTb-GFP-CP和pFastBacHTb-GFP-SP。酶切和测序鉴定证明了其序列的正确性并且无移码现象发生。将此质粒转化入含穿梭载体bacmid的感受态细胞DH10Bhac，得到含有目的基因片段的重组杆状病毒穿梭质粒rb-GFP-CP和rb-GFP-SP。rb-GFP-CP和rb-GFP-SP转染sf9昆虫细胞，经24 h～72 h后，在显微镜200倍可见光视野下发现：细胞和细胞核变大，细胞内颗粒物增多，细胞脱落甚至裂解等一系列与正常的sf9昆虫细胞形态有明显区别的现象。荧光显微镜下可见细胞发出清晰的绿色荧光，被rb-GFP-SP转染的细胞所发出的大部分荧光集中在细胞质部分，而被rb-GFP、rb-GFP-CP转染的细胞则无此现象。取72 hpi的细胞再行观察，发现发出荧光的细胞数量明显增加，表明蛋白的表达量加大。同时，激光共聚焦显微观察证明了①被rb-GFP-CP、rb-GFP-SP侵染72 h后的细胞破裂严重；②被rb-GFP-SP侵染的细胞内大部分地方被膨大的核占有，所发出的荧光大部分集中在细胞质，而被rb-GFP、rb-GFP-CP侵染的细胞所发出的荧光则在整个细胞内。②被rb-GFP-CP、rb-GFP-SP侵染的细胞所发出的荧光显示有类似“包涵体”形式的结构存在。这些结果表明GFP-CP、GFP-SP融合蛋白在sf9昆虫细胞内成功表达。本实验为研究蛋白的真核表达及亚细胞定位提供了一些思路。